数字PCR技术检测rAAV产品中质粒DNA残留*

来源：药物分析杂志2023年第12期北京时间：

作者：凡文超, 于雷, 安怡方, 王光裕, 史新昌, 周勇

单位：中国食品药品检定研究院,北京 100050

摘要：目的:利用数字PCR(dPCR)技术检测重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)产品中质粒DNA残留。方法:针对质粒抗性基因KanR序列的4个不同区段设计引物探针,建立单重和双重dPCR检测KanR残留量;在双重dPCR中,双阳性孔代表2组引物对之间的序列完整,通过测试单、双阳性孔的比例,评价KanR序列的分布情况;利用DNase Ⅰ消化游离的质粒DNA,评价病毒衣壳内错包装的质粒DNA情况。结果:4组单重dPCR实测KanR残留量之间基本一致(1.054×108~1.467×108 copies·μL-1);双重dPCR与单重dPCR实测结果间无明显差异;双重dPCR在6~6 000 copies·μL-1浓度范围内显示出良好的线性关系(r＞0.999)和重复性(RSD<20%);1/2,2/3和3/43种组合的双重PCR的双阳性孔占比基本一致,表明KanR基因的断裂可能更趋向于随机断裂;DNase Ⅰ处理前后结果提示,错包装的大片段质粒DNA(1/4双阳性)比游离的占比更高。结论:dPCR技术可用于检测rAAV产品中质粒DNA残留量,多重dPCR还可评估质粒DNA片段大小及分布情况。

关键词：数字PCR,重组腺相关病毒,质粒DNA残留,KanR基因,

基金资助：*北京市科技计划资助(Z221100007922015)