苛养型人腺病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立*

来源：药物分析杂志2025年第7期北京时间：

作者：董莹莹, 陈晓菲, 张峒, 刘明月, 张瑞瑞, 曹译丹, 李慧婷, 付欣悦, 王艳辉, 王新乐, 崔梦姗, 庞琳, 饶春明

单位：北京昭衍药物检定研究有限公司, 北京 100176

摘要：目的: 建立一种覆盖率高,敏感、特异的针对苛养型人腺病毒（HAdV）Hexon基因的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法,对人源生产用细胞基质和原材料进行苛养型HAdV检测。方法: 针对Hexon基因保守序列设计合成引物、探针及质粒对照品,将以腺相关病毒（AAV）为载体的HAdV（AAV-HAdV）假病毒作为阳性对照样品,含HAdV的F亚属（HAdV-F）基因序列的质粒作为扩增对照,全面验证该检测方法的线性、灵敏度、特异性、耐用性和重复性,确保其可应用于生物制剂及其原材料的苛养型HAdV安全评价。结果: 该检测方法对病毒毒株覆盖率高,可覆盖100%的HAdV-F毒株（94个分离株）;质粒对照品在20~2×108 copies · μL-1具有良好的线性关系,R2可达1.000;检测灵敏度可达到4 copies · μL-1;具有良好的特异性,对人腺病毒5型和人腺病毒2型不能进行特异性扩增;具有良好的耐用性,使用2款不同型号的仪器检测,标准曲线R2分别为0.999和1.000,灵敏度循环阈值（Ct）分别为37.22±0.62和36.50±0.58,阳性对照样品Ct分别为21.67±0.03和20.61±0.18,各项检测结果无明显差异;使用2种不同货号试剂检测,标准曲线R2均为1.000,灵敏度Ct分别为37.99±1.19和38.31±0.97,阳性对照样品Ct分别为19.69±0.09和20.58±0.05,各项检测结果无明显差异;在不同人员或不同仪器的条件下进行中间精密度验证,4次实验HAdV-F质粒扩增对照的检测结果分别为1.29×105、1.54×105、1.73×105、1.37×105 copies · μL-1,RSD为13.2%,中间精密度良好;AAV-HAdV假病毒作为阳性对照样品对人间充质干细胞样品进行适用性验证,阳性对照样品检测结果为137 copies · μL-1,适用性样品检测结果为133 copies · μL-1,样品加标回收率为97.1%。结论: 该检测方法具有良好的线性、灵敏度、特异性、耐用性和重复性,且对苛养型HAdV毒株的覆盖率高,可用于生产用细胞基质样品中苛养型HAdV检测。

关键词：腺病毒,苛养型,实时荧光定量PCR,细胞库,外源病毒,检测,

基金资助：工业和信息化部2024年产业技术基础公共服务平台-创新药物筛选验证和检测评价公共服务平台项目（GN2024-31-4700）;北京市科技计划课题：基因修饰免疫细胞和基因治疗药物质量控制关键技术与服务平台建设（Z221100007922015）