慢病毒载体CV2117-HAV-HTLV2假病毒的构建及其应用*

来源：药物分析杂志2025年第7期北京时间：

作者：房吉庆, 魏夏杰, 袁子维, 王瑶, 李瑶玲, 杨英, 饶春明

单位：北京昭衍药物检定研究有限公司, 北京 102605

摘要：目的: 构建含多个RNA病毒（CV2117、HAV和HTLV-2）基因的慢病毒载体假病毒,用于生物制品中外源RNA病毒PCR检测的阳性对照。方法: 选用三质粒慢病毒包装体系,即包膜质粒（pMD2.G）、包装质粒（psPAX2）和穿梭质粒（pWPXL-EGFP）,合成含多个目的基因片段的穿梭载体,pWPXL-CV2117-HAV-HTLV-2-EGFP（pCHH-EGFP质粒）,包膜质粒-包装质粒-穿梭质粒按照1 ∶ 3 ∶ 4 转染HEK293T/17细胞包装假病毒,5 h后更换新鲜DMEM完全培养基,培养24 h后加入核酸酶酶解残余质粒DNA,收获转染后48 h和72 h病毒上清液;将病毒上清10倍稀释后加入到HEK293T/17细胞中,感染24 h后更换新鲜培养基,继续培养48 h,荧光显微镜观察病毒感染情况,流式细胞术检测病毒感染滴度,逆转录-实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测假病毒目的基因拷贝数,具体步骤包括①预处理（42 ℃ 2 min）、②反转录（25 ℃ 5 min,1个循环;42 ℃ 30 min,1个循环;85 ℃ 5 min,1个循环）、③PCR扩增（37 ℃ 2 min,1个循环;95 ℃预变性10 min,1个循环;95 ℃变性15 s,60 ℃退火1 min,40个循环）;获得的假病毒采用人间充质干细胞样品进行样品适用性验证。结果: 三质粒慢病毒包装体系转染HEK293T/17细胞的增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）阳性率>90%;PCR方法检测假病毒在核酸酶处理后,质粒DNA残留<0.005%;经流式细胞术检测慢病毒感染滴度,表达EGFP阳性细胞数占比为8.06%,病毒感染滴度为6.21×105 TU · mL-1;RT-qPCR方法检测目的基因CV2117-1、CV2117-2、HAV-1、HAV-2、HTLV-2-1、HTLV-2-2拷贝数分别为2.99×104、1.50×104、2.40×104、1.09×104、2.03×104、1.92×104 copies · μL-1。样品适用性结果显示,慢病毒载体（lentivirus vector,LV）CV2117-HAV-HTLV2（LV-CHH）假病毒可用于间充质干细胞检测的阳性对照,适用性样品回收率为70%~130%。结论: 成功构建含多个RNA病毒基因片段的LV-CHH假病毒,经验证可用于干细胞产品等的外源病毒PCR方法检测的阳性对照。

关键词：慢病毒载体,假病毒,逆转录-实时荧光定量PCR,干细胞,外源病毒检测,流式细胞术,

基金资助：^*北京市科技计划课题：基因修饰免疫细胞和基因治疗药物质量控制关键技术与服务平台建设（Z221100007922015）