Adv载体PCV3-B19-TTSuV1假病毒作为PCR检测阳性对照的研究与应用*

来源：药物分析杂志2025年第10期北京时间：

作者：李瑶玲, 王瑶, 房吉庆, 袁子维, 杨英, 饶春明

单位：北京昭衍药物检定研究有限公司,北京 102605

摘要：目的: 通过荧光定量PCR（qPCR）和微滴数字PCR（ddPCR）技术评价多基因假病毒作为外源病毒PCR检测阳性对照的可行性。方法: 采用qPCR法和ddPCR法检测Adv载体PCV3-B19-TTSuV1假病毒（以下简称为PBT3）中4个基因片段的拷贝数,并进行比较研究;采用ddPCR法检测PBT3假病毒B19基因拷贝数,以2倍进行稀释,选择3个倍比稀释度,评价ddPCR法检测假病毒基因拷贝数的准确性;采用ddPCR法检测pDC-PBT3质粒DNA对照品拷贝数,与吸收度法计算的理论拷贝数进行比较研究;采用qPCR法检测人间充质干细胞中B19病毒,评价PBT3假病毒作为外源病毒PCR检测阳性对照的适用性。结果: 采用qPCR法检测,结果显示PBT3假病毒4个基因片段的拷贝数分别为（8.23±0.62）×105、（8.58±1.35）×105、（9.66±0.12）×105和（8.17±0.36）×105 copies · µL-1,4个基因片段拷贝数比例为1.00 ∶ 1.04 ∶ 1.17 ∶ 0.99,接近1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1;采用ddPCR法检测,结果显示PBT3假病毒4个基因片段的拷贝数分别为（4.62±0.23）×105、（4.84±0.01）×105、（4.92±0.04）×105和（4.62±0.12）×105 copies · µL-1,4个基因片段拷贝数比例为1.00 ∶ 1.05 ∶ 1.06 ∶ 1.00,接近1 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 1。ddPCR法扩增倍比稀释的PBT3假病毒B19基因片段,阳性微滴比例为4.00 ∶ 2.05 ∶ 1.16。ddPCR法与qPCR法的比较研究结果显示,ddPCR法测得PBT3假病毒基因拷贝数为qPCR法检测结果的0.51~0.57倍,ddPCR法测得pDC-PBT3质粒DNA拷贝数与经典吸收度法拷贝数的理论值比值在0.47~0.75。进一步的应用研究结果显示,qPCR法检测人间充质干细胞B19病毒的2个基因片段的适用性样品回收率分别为68.2%和72.0%。结论: 多基因假病毒可作为外源病毒PCR检测的阳性对照,具有经济、安全及质量可控等优点。

关键词：多基因假病毒,荧光定量PCR,微滴数字PCR,基因拷贝数,阳性对照,猪圆环病毒3（PCV3）,人细小病毒B19,猪细环病毒Ⅰ型（TTSuV1）,人间充质干细胞,

基金资助：北京市科技计划课题：基因修饰免疫细胞和基因治疗药物质量控制关键技术与服务平台建设（Z221100007922015）