HPLC-MS/MS法检测人血清中7个维生素D及其代谢产物*

来源：药物分析杂志2026年第5期北京时间：

作者：李佩, 潘荆珏, 赵国芳

单位：宁波市第二医院,宁波 315040

摘要：目的: 建立液液萃取-衍生化联合高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）法对人血清中7个维生素D及其代谢产物的含量进行准确定量分析。方法: 采用甲醇-异丙醇（8 ∶ 2,含0.3%甲酸）作为蛋白质变性试剂,正己烷-乙酸乙酯（7 ∶ 3）作为萃取剂,进行液液萃取;添加衍生化试剂4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮（PTAD）25 μg,衍生化反应1 h达到稳定;采用Waters Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm,1.7 μm）,柱温40 ℃,以均含0.1%甲酸-2.5 mmol · L-1甲酸铵的水和甲醇溶液作为流动相,进行梯度淋洗,流速0.3 mL · min-1;采用电喷雾正离子源（ESI+）,多反应监测模式（MRM）检测。结果: 在2、20、200 μg · L-1 3个加标浓度下,7个维生素D及其代谢产物（维生素D2、维生素D3、25-羟基维生素D2、25-羟基维生素D3、1,25-二羟基维生素D2、1,25-二羟基维生素D3、24R,25-二羟基维生素D3）的加标回收率范围为（71.3±3.5）%~（115.9±10.6）%;其质量浓度在0.25~80 μg · L-1范围内,r为0.998 4~0.998 8;方法检测限和定量限分别为0.022~0.10 μg · L-1和0.073~0.34 μg · L-1;日内及日间精密度分别为4.1%~11.3%和6.5%~15.0%。使用本研究方法检测了30例60岁以上人群血清中维生素D及其代谢产物,7个化合物均有检出,其中25-羟基维生素D3、1,25-二羟基维生素D3、24R,25-二羟基维生素D3为主要代谢产物,中位数浓度分别达到4.30、2.37和0.57 μg · L-1。结论: 本方法快速高通量,大约5 h内可完成血清中7个维生素D及其代谢产物的同时定量检测。准确度和灵敏度高,稳定性好,检测限比文献报道低约1个数量级。

关键词：高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）,血清,维生素D及其代谢产物,4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮（PTAD）,衍生化,液液萃取,蛋白质变性,同位素稀释,

基金资助：国家自然科学基金资助项目（No.42307378）;宁波市医疗卫生高端团队重大攻坚项目（No.2022030208）;宁波市第二医院华美研究基金项目（No.2023HMZD09）