基于hutC基因的洋葱伯克霍尔德菌群RT-qPCR检测方法的建立*

来源：药物分析杂志2026年第7期北京时间：

作者：余萌, 王似锦, 张迅迪, 马仕洪

单位：1.中国食品药品检定研究院 药品监管科学全国重点实验室,北京 100050; 2.中国药科大学,南京 211198

摘要：目的: 为快速识别药品生产过程中洋葱伯克霍尔德菌群（Burkholderia cepacia complex,Bcc）的污染风险,建立基于管家基因hutC的实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测方法。方法: 分析Bcc及其近缘菌的hutC基因核苷酸序列,针对hutC基因保守区设计特异性TaqMan探针和引物,同时设计内扩增对照（internal amplification control,IAC）探针。对建立的方法进行反应体系与条件优化,使用Bcc及非Bcc菌株进行验证,评价RT-qPCR方法的专属性、扩增效率与检测限等参数。采用药典方法与建立的RT-qPCR方法,对20份模拟水基质样品进行Bcc检测。结果: 优化后的反应体系中,上、下游引物终浓度均为200 nmol · L-1,hutC探针终浓度为200 nmol · L-1,IAC探针终浓度为400 nmol · L-1,IAC模板DNA 1 μL（1.3×10-5 ng · μL-1）。经实验验证,12株Bcc菌株均呈特异性扩增,21株非Bcc菌株（包括同属近缘菌种、药典常见控制菌及水系统常见革兰阴性菌）均未检出特异性扩增;引入IAC时,该方法对hutC重组质粒的扩增效率为101%,对B.cepacia ATCC 25416菌液的扩增效率为88%;检测限为14 CFU · 反应-1。20份模拟的水基质样品的定性检测结果与药典方法结果一致,检测时间由6~7 d缩短至24 h。结论: 本研究建立的RT-qPCR检测方法,可用于快速、特异检测高风险水基质药品、中间产品、原辅料中污染的Bcc,具备作为药品生产风险控制方法的潜力。

关键词：洋葱伯克霍尔德菌群,hutC基因,实时荧光定量PCR,水基质药品,微生物快速检测方法,

基金资助：药品监管科学全国重点实验室课题（2025SKLDRS0308）