柔嫩艾美耳球虫5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶基因的克隆、原核表达及酶活性分析

来源：畜牧兽医学报杂志2015年第4期北京时间：

作者：廖申权，吴彩艳，戚南山，李娟，吕敏娜，张健騑，谢明权，孙铭飞

单位：广东省农业科学院动物卫生研究所，广东省畜禽疫病防治研究重点实验室，广东省兽医公共卫生公共实验室，广州 510640

摘要：旨在克隆柔嫩艾美耳球虫5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶（EtDXR）基因，初步分析EtDXR的酶活性。根据EuPathDB数据库信息注释、拼接Etdxr基因序列，设计特异性引物扩增Etdxr基因，构建原核表达质粒pCold I-EtDXR，转化E.coli Rosetta（DE3），IPTG诱导表达，进行SDS-PAGE及Western blot分析，纯化rEtDXR，对rEtDXR进行酶活性分析，测定pH和Mg2+离子浓度对酶活性的影响。结果显示，Etdxr基因完整编码序列为1 746 bp，氨基酸序列具有与其他物种高度保守的酶活性中心；成功构建原核表达质粒pCold I-EtDXR，SDS-PAGE以及Western blot分析显示，得到约50 ku的蛋白质；利用直接检测底物NADPH 消耗速率的方法分析EtDXR酶活性，结果显示，不同pH和离子浓度对EtDXR的酶活性有显著影响，其最佳的酶反应条件为pH 7.0，Mg2+离子浓度4.5 mmol•L-1。本研究为进一步以EtDXR为药靶筛选抗球虫先导化合物奠定了基础。

关键词：

基金资助：国家自然科学基金项目 (31201902；31302087；31402186)；广州市珠江科技新星项目（2012J2200059）；广东省自然科学基金项目（S2013040015220）；广东省科技计划项目（2011B050700007）；广州市科技计划项目（2014J4100230）；广东省农业科学院院长基金（201413）