猪LTβR基因克隆、结构功能预测、组织表达谱分析及真核表达载体构建

来源：畜牧兽医学报杂志2015年第12期北京时间：

作者：吴正常，戴超辉，殷学梅，孙寿永，包文斌，吴圣龙

单位：1.扬州大学动物科学与技术学院 江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室，扬州 225009；2.江苏省种猪繁育和健康养殖工程技术研究中心，扬州 225009

摘要：为了进一步探究猪LTβR基因的生物学功能，本研究以猪淋巴组织cDNA为模板扩增LTβR基因CDS区，进一步利用生物信息学对猪LTβR蛋白结构与功能以及参与的GO和Pathway通路进行分析，利用Real-time PCR检测LTβR基因在大白猪不同组织中的表达水平，同时将LTβR基因扩增产物克隆至真核表达载体pEGFP-C1中，并分别转染猪HEK293和IPEC-J2小肠上皮细胞系，通过显微镜观察其表达情况。结果表明，克隆获得猪LTβR基因CDS区全长为1 209 bp，编码402个氨基酸，发现LTβR为脂溶亲水性的不稳定蛋白，存在1个跨膜结构（205~227 aa），不存在信号肽，亚细胞定位表明LTβR为非分泌型蛋白。LTβR蛋白具有2个糖基化位点，18个潜在的磷酸化位点，其中包括PKC、CKI、CDC2、GSK3、CDK5、INSR等10种保守的特异性蛋白质激酶的结合位点。该蛋白保守区域为2个TNFR superfamily，分别位于32~125和128~192位氨基酸，并发现C422T>A141V突变位于该区域内。KEGG和GO分析发现，LTβR基因共参与12项GO功能分类，同时还参与NF-kappa B信号通路、IgA 合成的肠道免疫网络等5项调控通路。定量检测发现，LTβR基因在大白猪肺中的表达水平极显著高于其他组织（P<0.01），在肾和脾等免疫器官，十二指肠和空肠等肠道组织中也均有较高的表达水平。细胞水平转染试验及显微镜观察发现其在猪HEK293和IPEC-J2两种细胞中均表达。本研究为猪LTβR基因及其介导的信号通路的功能分析提供了材料和依据，今后有必要在细胞水平上进一步验证分析猪LTβR基因及其介导的信号通路在猪抵抗细菌感染过程中发挥的重要作用，同时将C422T突变作为猪抗病育种的一个潜在遗传标记进行系统分析。

关键词：

基金资助：转基因生物新品种培育科技重大专项（2014ZX08006-001B）；国家自然科学基金（31372285；31172183）；江苏高校优势学科建设工程资助项目(PAPD)