利用CRISPR/Cas 9技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统及其初步应用

来源：畜牧兽医学报杂志2016年第4期北京时间：

作者：余深翼，赵金荣，郑玲红，朱二鹏，周五朵，吴宝成

单位：福建农林大学动物科学学院预防兽医实验室，福州 350002

摘要：旨在利用CRISPR/Cas 9新型基因编辑技术构建大肠杆菌aroA基因的敲除系统，并分析其对不同大肠杆菌aroA基因敲除、修复的差异。首先构建靶向aroA基因的CRISPR/Cas 9载体；随后人工设计同源修复供体基因序列，并亚克隆到CRISPR/Cas 9载体中，构建成完整的CRISPR/Cas 9基因敲除体系；将该系统分别应用到大肠杆菌DH10B、DH5α和JM109细胞中，PCR鉴定筛选到的阳性菌株，并回收其扩增条带进行克隆、测序。CRISPR/Cas 9载体的酶切与测序结果均正确，表明载体构建成功；PCR鉴定结果显示，该系统对三种大肠杆菌均能进行aroA基因的有效敲除，敲除效率为46%~58%；测序结果进一步证实目的基因敲除成功。本试验成功构建大肠杆菌aroA基因CRISPR/Cas 9敲除系统，为进一步研究致病菌aroA基因功能及开发减毒大肠杆菌疫苗提供新型、有效的基因敲除工具。

关键词：

基金资助：福建省畜禽新发疫病诊断和防治技术研究（ky0040052）