猪MC4R基因突变体真核表达载体的构建及功能研究

来源：畜牧兽医学报杂志2016年第4期北京时间：

作者：韩立强，郭豫杰，鲁维飞，张欣，褚贝贝，王江，杨国宇

单位：1.河南农业大学 农业部动物生化与营养重点实验室，郑州 450002； 2.华中农业大学，教育部动物遗传育种与繁殖重点实验室，武汉 430070； 3.河南省现代畜牧业协同创新中心，郑州 450002

摘要：为研究MC4R基因不同突变体的功能差异，本研究从猪肌肉组织中克隆得到MC4R基因的编码序列，将克隆片段与pcDNA3.1真核表达载体进行Kpn Ⅰ 和EcoR Ⅰ双酶切，连接形成重组表达载体MC4R1，将载体转染BHK细胞后Western blotting 检测蛋白表达。通过点突变法得到MC4R基因在707/892位点的3个突变载体，将突变载体瞬时转染到BHK细胞，采用免疫荧光对细胞进行标记，通过激光共聚焦显微镜和流式细胞检测荧光表达，结果发现，克隆的MC4R1基因序列长度大约1 000 bp，在707/892位点序列为G/G，将构建的真核表达载体MC4R1转染BHK细胞，经过Western blotting 检测发现MC4R1蛋白正常表达；通过点突变法得到在707/892位点突变的突变载体MC4R2(G/A)、MC4R3(A/G)、MC4R4 (A/A)，经过激光共聚焦观察荧光表达后发现，突变受体在细胞膜上均有正常表达，流式检测发现4个突变受体表达的荧光平均强度并没有显著差异（P＞0.05）。通过构建MC4R基因突变载体后发现，707/892位点突变对于MC4R受体在细胞膜的表达没有显著影响，其具体机制作用还需深入研究。

关键词：

基金资助：农业部“引进国际先进农业科学技术”（948）重点项目(2011-G35)；国家转基因重大专项（2014ZX0801015B）；郑州市科技攻关项目（141PPTGG430）