猪圆环病毒2型交叉引物恒温扩增检测方法的建立

来源：畜牧兽医学报杂志2016年第9期北京时间：

作者：袁旦一，金亚南，李玲，何谦，胡林，李晓琪，孙志勇

单位：(1.四川纳比生物科技有限公司，成都 610041；2.杭州优思达生物技术有限公司，杭州 310053)

摘要：拟建立一种简便、快速、准确的现场快速分子检测方法，为猪圆环病毒2型（PCV2）疾病的生物安全防控提供技术支撑。采用交叉引物恒温扩增技术原理，根据PCV2 Cap基因设计一组交叉扩增引物，用构建的Cap基因重组质粒作为标准DNA模板，对反应体系的引物浓度、Betaine、MgSO4、dNTP、Bst酶、反应温度和时间进行优化，并结合核酸试纸条技术，建立可视化检测PCV2的交叉引物恒温扩增检测方法（PCV2-CPA）。用建立的CPA检测方法、常规PCR和ELISA方法检测经IFA方法标定的127份临床样品，比较这些方法的敏感性、特异性和符合率。结果显示，最佳反应体系为引物F3、B3各 0.5 μmol•L-1，CPR 1 μmol•L-1，DF5F 0.7 μmol•L-1、DF5B 0.9 μmol•L-1，Betaine 0.075 mol•L-1，MgSO4 3 mmol•L-1，dNTPs 0.4 mmol•L-1，Bst DNA 聚合酶9.6 U。建立的检测方法58 ℃ 扩增50 min，检测限可达7.6 拷贝•μL-1，灵敏度是常规PCR的10倍；与PCV1、PRV、CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV和RV无交叉反应。三种检测方法的敏感性分别为78.08%～94.52%，特异性为87.03%～92.59%，符合率为84.25%～91.34%，ROC曲线图显示三种检测方法中，CPA检测方法效能最优。建立的猪圆环病毒2型交叉引物恒温扩增检测方法不需要PCR仪，仅一台水浴锅或金属浴即可完成病毒DNA的扩增，密闭的核酸检测试纸条使结果判定直观、客观，且可有效避免气溶胶污染，可应用于猪圆环病毒2型的现场快速检测。

关键词：

基金资助：2015年度勃林格中国猪圆环病毒病研究进步奖项目