山羊INSIG1基因超表达对乳腺上皮细胞中脂质合成的影响

来源：畜牧兽医学报杂志2016年第9期北京时间：

作者：王苗，罗军，许会芬，朱江江，赫秋亚，姚大为，史怀平

单位：(西北农林科技大学动物科技学院，陕西省农业分子生物学重点实验室，杨凌 712100)

摘要：本研究旨在通过构建西农萨能奶山羊胰岛素诱导基因1 (INSIG1) 的重组腺病毒(Adenovirus，Ad) 超表达载体，研究该基因超表达后对乳腺上皮细胞中脂质合成的影响，从而为该基因在山羊乳腺脂质合成调控中的功能研究奠定基础。根据GenBank (登录号：JQ665439)中山羊INSIG1基因序列设计引物，PCR扩增得到其CDS区序列。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV后获得pAdTrack-CMV-INSIG1质粒，将该质粒Pme Ⅰ线性化后转入大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行同源重组，获得pAdEasy-INSIG1重组腺病毒超表达载体。该重组质粒经Pac Ⅰ线性化后转染293A细胞进行病毒的包装及扩繁，利用LaSRT法测定其滴度。将获得的重组腺病毒Ad-INSIG1感染山羊原代乳腺上皮细胞，利用实时荧光定量PCR检测INSIG1及脂质合成相关基因的mRNA表达情况，利用GPO-Trinder酶学反应检测细胞中甘油三酯的含量。结果表明，成功构建了奶山羊INSIG1基因重组腺病毒超表达载体，获得了具有较高滴度 (2×108 U•mL-1) 的超表达腺病毒Ad-INSIG1；Ad-INSIG1感染山羊原代乳腺上皮细胞48 h后，与Ad-GFP组相比，INSIG1基因的mRNA表达量上调约500倍，固醇调节元件结合蛋白1 (SREBP1)和SREBP裂解活化蛋白 (SCAP) 的mRNA表达量无明显变化，参与脂肪酸从头合成 (ACCα、FASN) 及去饱和 (SCD1) 基因的mRNA表达量均显著下降 (P<0.05)；参与甘油三酯合成的3个关键基因中，GPAM及DGAT2的mRNA表达量显著下降 (P<0.05)，AGPAT6的表达无显著变化；同时，催化甘油三酯分解 (ATGL)的基因mRNA表达量也显著下降 (P<0.05)；细胞内甘油三酯含量无显著变化。综上所述，在山羊原代乳腺上皮细胞中，INSIG1能够抑制脂质合成相关基因的表达，对山羊乳腺脂质合成具有调控作用。

关键词：

基金资助：国家自然科学基金项目(31372281)；国家转基因新品种培育重大专项(2014ZX08009-051B)