猪ELF4基因的克隆、蛋白表达及其多克隆抗体制备

来源：畜牧兽医学报杂志2017年第3期北京时间：

作者：王瑾，唐青海，谷雅静，李晓楠，李羽，王雪雨，姚伦广，阚云超

单位：1. 南阳师范学院 河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室/昆虫生物反应器河南省工程实验室，南阳 473061；2. 衡阳师范学院生命科学与环境学院 生物药物研究所，衡阳 421008

摘要：本研究旨在克隆猪转录因子ELF4基因，体外表达ELF4蛋白并制备抗该蛋白的多克隆抗体。采用RT-PCR扩增猪ELF4基因，运用生物信息学软件分析其核苷酸和编码氨基酸序列特征，将其克隆至原核表达载体pET28a，构建重组表达载体pET28a-pELF4，转化Rosetta（DE3）菌株，在不同温度、IPTG浓度、诱导时间等条件下进行诱导表达，采用SDS-PAGE和Western blot分析蛋白表达，重组pELF4蛋白（rpELF4）经纯化免疫鸡制备抗pELF4 抗体。结果表明，pELF4开放阅读框为1 989 bp （GenBank No.：KU097322），编码662个氨基酸，该基因与已经测定的人、牛、小鼠的ELF4的核苷酸相似性依次为89.4%、90.7%和81.1%，与牛等大动物的亲缘关系相对较近，与人和小鼠亲缘关系相对较远；结果显示，成功表达了重组蛋白pELF4，rpELF4分子量为95 ku，该蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在，在37 ℃条件下，以终浓度为0.8 mmol•L -1 IPTG诱导8 h包涵体表达量达到最高。第4次免疫后第13天，鸡抗rpELF4抗体滴度达到1︰256 000倍以上。本试验利用原核表达系统成功制备了重组pELF4蛋白，并制备了免疫活性和特异性良好的鸡抗pELF4多克隆抗体，为该蛋白生物学功能及相关疾病研究提供了基础材料。

关键词：

基金资助：国家自然科学基金青年基金（31101837）；河南省重点科技攻关项目（142102110101）；衡阳师范学院引进人才专项项目；河南省高等学校重点科研项目（16A230023）