猪肺炎支原体不同毒力菌株对猪气管上皮3D细胞的损伤差异与机制分析

来源：畜牧兽医学报杂志2018年第2期北京时间：

作者：冯艳艳, 王海燕, 刘蓓蓓, 韦艳娜, 张珍珍, 白昀, 倪博, 邵国青, 雷治海, 冯志新

单位：1. 南京农业大学动物医学院, 南京 210095;2. 江苏省农业科学院兽医研究所·农业部兽用生物制品工程技术重点实验室, 南京 210014

摘要：为更真实地探究猪肺炎支原体（Mhp）不同毒力菌株对猪气管上皮细胞（STEC）的致病性差异与机制，通过气液界面培养技术（ALI），建立了传代STEC细胞系3D分化培养模型及Mhp在此细胞上的感染模型。将相同剂量的Mhp强毒株NJ株、中等毒力菌株AH株和弱毒株168L株分别感染3D培养的猪气管上皮细胞，分别通过单层细胞跨膜电阻检测、Alamar Blue检测、乳酸脱氢酶（LDH）释放检测等试验测定细胞单层完整性与细胞活性，并通过激光共聚焦和荧光分光光度计测定感染后48 h的细胞MUC5B黏液蛋白的分泌量，从细胞生长特性、活性和黏液分泌功能方面比较不同毒力Mhp菌株感染对STEC分化细胞的影响。研究还从细胞氧化系统方面，比较检测各感染组细胞内NO和内源性ROS分泌量，进一步探索Mhp的致病机制。结果表明：强毒株NJ株和中等毒力AH株组纤毛有明显的变粗、破损和脱落现象，而弱毒株168L株组对纤毛的影响较小；Mhp菌株感染后细胞单层跨膜电阻显著下降，且电阻下降程度与菌株毒力呈正相关。Alamar Blue检测试验、乳酸脱氢酶（LDH）释放检测结果均表明，Mhp NJ株与AH株感染后均可以显著降低细胞活性，且在感染后48 h最明显。Mhp菌株感染后还可促进分化细胞分泌MUC5B黏蛋白，菌株毒力越强，刺激黏蛋白分泌的量也越多。氧化应激检测结果显示，除Mhp弱毒菌株168L株外，中等毒力菌株AH株和强毒株NJ株感染3D分化的STEC细胞后，可显著刺激细胞分泌NO和内源性ROS，显著引起细胞的氧化应激反应。而经NAC抗氧化处理后，强毒株NJ株、中等毒力AH株和弱毒株168L株组细胞ROS和黏液分泌量均显著降低，细胞活性和电阻值均显著升高。本研究通过更接近体内环境的3D分化细胞感染模型证明，Mhp感染可对宿主细胞的生长特性与活性产生损伤，且损伤的程度与毒力呈正相关；而这种损伤机制与Mhp菌株引起感染细胞氧化应激的能力密切相关。

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基金资助：江苏省农业科技自主创新资金项目（CX（14）2040）；国家自然科学基金面上项目（31370208）