干扰和稳定表达GP5对猪繁殖与呼吸综合征病毒感染早期复制的影响

来源：畜牧兽医学报杂志2018年第6期北京时间：

作者：宋林林, 贾存瑜, 韩熙梦, 周恩民, 穆杨

单位：1. 西北农林科技大学动物医学院, 杨凌 712100;2. 农业部兽用药物与诊断技术陕西科学观测实验站, 杨凌 712100

摘要：为探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）主要结构蛋白GP5对病毒复制的影响及其机制，利用PiggyBac Transposon载体系统构建表达GP5的重组质粒（pPB-GP5），转染Marc-145细胞通过嘌呤霉素抗性筛选和3次亚克隆，获得稳定表达GP5的Marc-145细胞，在确定GP5表达不影响细胞增殖的基础上，用PRRSV感染筛选的细胞，通过N基因拷贝数、N蛋白表达水平和病毒滴度检测确定GP5表达对病毒复制的影响，并采用ELISA方法检测培养上清中IFN-α、IFN-β、IFN-γ的水平；进一步针对PRRSV ORF5编码区设计合成3对特异性siRNA，转染Marc-145细胞6和12 h后以0.1 MOI病毒感染细胞，感染后24 h收集细胞，采用荧光定量PCR（qPCR）检测GP5 mRNA的表达，采用Western blot检测PRRSV N蛋白的表达。结果显示：经RT-PCR、Western blot和IFA检测，确定GP5在Marc-145细胞中获得稳定表达，且不影响细胞增殖，但可以在感染早期促进PRRSV在细胞中的复制，这种促进作用可能是通过下调IFN的表达发挥的；与阴性对照siRNA相比，3对特异性siRNA均能抑制PRRSV复制，其中100 nmol·L-1的siRNA GP5-471的抑制效果最好。研究表明GP5在PRRSV复制中发挥着重要作用。

关键词：

基金资助：国家自然科学基金青年项目（31201883）；国家自然科学基金重点项目（31430084）