鸭肠炎病毒疫苗株EvaGreen实时荧光定量PCR方法的建立

来源：畜牧兽医学报杂志2018年第7期北京时间：

作者：万春和, 刘荣昌, 程龙飞, 傅光华, 施少华, 陈红梅, 傅秋玲, 黄瑜

单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所, 福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心/福建省禽病防治重点实验室, 福州 350013

摘要：鸭肠炎病毒（duck enteritis virus，DEV）疫苗株自1960年以来一直被用于防控DEV感染，该疫苗安全稳定、生产技术成熟、可快速诱导机体体液免疫和细胞免疫。DEV的基因组庞大，复制非必需区多，可容纳多个外源基因的插入，被广泛用来作为基因工程载体来开发疫苗。当前，尚未见仅针对DEV疫苗株的实时荧光定量PCR检测方法相关研究报道。本研究通过分析DEV疫苗株和强毒株UL2基因特点，明确DEV疫苗株在UL2基因上存在528 bp连续核苷酸缺失，设计针对该差异的实时荧光定量PCR引物，建立了EvaGreen实时荧光定量PCR检测DEV疫苗株的方法。结果表明，建立的检测DEV疫苗株实时荧光定量检测方法，当UL2基因含量为5.25×101~5.25×106拷贝·μL-1时有良好的线性扩增，其标准曲线方程Y轴截距为34.95，斜率为-3.218，扩增相关系数为0.999，扩增效率为100%；敏感性强，最低检测限为52.5拷贝·μL-1；特异性好，对DEV疫苗株扩增产物的熔解曲线分析，仅出现1个单特异峰值[Tm=（90.62±0.28）℃]，无引物二聚体，对其他鸭源传染病病原（如鸭肠炎病毒强毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、番鸭源鹅细小病毒、新型基因重组型鸭细小病毒、鸭腺病毒A型、鸭源鹅多瘤病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌）检测均为阴性；重复性好，组内变异系数和组间变异系数分别为0.55%~1.72%和0.92%~2.49%。本研究建立了DEV疫苗株实时荧光定量检测方法，为评价DEV活载体基因工程疫苗免疫防控机制提供参考。

关键词：

基金资助：国家自然科学基金（31602068）；国家水禽产业体系（CARS-42）；福建省农业科学院青年科技创新团队（STIT2017-3-10）；福建省农业科学院青年科技英才项目（YC2015-12）；福建省属公益类科研院所基本科研项目（2018R1023-5；2017R1023-7）