基于RNA适配体检测体外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP

来源：畜牧兽医学报杂志2018年第10期北京时间：

作者：朱彦策, 孔江南, 陈慧心, 钟凯, 张超

单位：河南农业大学 农业部动物生化与营养重点开放实验室, 郑州 450002

摘要：旨在建立简单、快速的检测体外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP的方法。本研究以含有T7启动子、VC2 GEMM-1核糖开关序列或其突变序列VC2/g20a、spinach2和tRNA序列的双链DNA为模板，利用T7 RNA聚合酶体外转录体系制备VC2、VC2/g20a RNA适配体。通过检测绿色荧光强度分析RNA适配体对c-di-GMP和cGAMP的结合能力。结果表明，转录得到的RNA经过加热变性、缓慢退火后得到VC2 RNA适配体和VC2/g20a RNA适配体，在125 mmol·L-1 KCl和30 mmol·L-1 MgCl2溶液中孵育180 min的优化结合条件下，VC2适配体与c-di-GMP特异性结合，VC2/g20a适配体与cGAMP特异性结合；c-di-GMP对VC2适配体的半数效应浓度（EC50）为（89±1.7）nmol·L-1，cGAMP对VC2/g20a适配体的半数效应浓度为（309±4.5）nmol·L-1；VC2和VC2/g20a能够分别检测低至5 nmol·L-1和20 nmol·L-1的c-di-GMP和cGAMP；并且发现转录的RNA混合物在未纯化的情况下同样能够检测VC0179体外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP。这种方法可以简单快速的检测VC0179体外酶促合成的c-di-GMP和cGAMP，并且为研究其他c-di-GMP和cGAMP合成酶活性提供潜在可能。

关键词：

基金资助：河南省基础与前沿技术研究计划项目（142300410153）；河南农业大学科技创新计划（30600967）；河南省自然科学基金资助项目（132300410002）