绵羊PLC-γ1基因真核表达载体的构建及鉴定
来源：石河子大学学报·自然科学版杂志2023年第4期北京时间：
作者：袁利明, 陈云蕾, 刘素平, 丁林玲, 吴兰, 赛务加甫
单位：1 石河子大学动物科技学院,新疆 石河子 832000;<br/>2 西北农林科技大学,陕西 杨凌 712100;<br/>3 桐庐无规定马属动物疫病区管理中心,浙江 杭州 310000
摘要：目的旨在构建携带红色荧光蛋白(RFP)报告基因的绵羊PLC-γ1非融合性真核表达载体。方法在原有PUC57-PLC-γ1克隆载体基础上,对目的片段N端前加入P2A序列和3个连续Flag序列后使用HindⅢ酶和SalⅠ酶双酶切获得P2A-3×Flag-PLC-γ1片段,将其连接至pDsRed2-C1载体获得重组质粒pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1;然后采用Lip2000转染试剂将该重组质粒转染至HEK-293T细胞,最后利用荧光显微镜、qRT-PCR、Westernblot、免疫共沉淀(IP)和免疫荧光(IF)法鉴定重组质粒pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1的表达及亚细胞定位情况。结果双酶切和测序结果显示质粒pDsRed2-C1-P2A-3×Flag-PLC-γ1构建成功,观察到红色荧光;免疫荧光的亚细胞定位检测出PLC-γ1蛋白在细胞质中表达;qRT-PCR和Westernblotting法均能检测出PLC-γ1表达,与对照组有显著性差异(P>0.01);免疫共沉淀也纯化分离出含有Flag标签的PLC-γ1蛋白。结论本研究成功构建绵羊PLC-γ1基因的真核表达载体,在P2A肽作用下实现目的蛋白PLC-γ1与DsRed2的表达,构建的载体可用于研究PLC-γ1在早期胚胎发育中的作用。
关键词：P2A肽,PLC-γ1,绵羊,HEK-293T细胞,Flag标签
基金资助：国家自然科学基金项目(31860725)
