农药学学报杂志投稿格式参考范文：蚕豆对除草剂灭草松耐药基因挖掘

　　引言

　　蚕豆(Vicia faba L.)性喜温暖、凉爽、忌暑热的气候，一直是青藏高原的优势农产品，具有益气健脾、消除水肿、增强记忆力、健脑等功效。蚕豆田杂草危害，严重影响蚕豆的产量和品质 [1-3]。除草剂灭草松(bentazone)具有防效优、杀草谱广等特点，可有效防除蚕豆田阔叶杂草 [4]。灭草松属于光系统 Ⅱ 抑制剂，其作用机制是破坏 D1 蛋白，从而阻断非环式光合电子传递链，抑制光合作用，导致敏感性植株死亡 [5]。研究发现，高浓度灭草松会对部分蚕豆品种产生药害 [6]，因此了解灭草松在蚕豆体内的代谢解毒机制有重要意义。

　　植物为抵御逆境胁迫带来的伤害会增加抗氧化酶和解毒酶活性。例如，水稻和大豆经氯磺隆及胺苯磺隆处理后过氧化物酶(POD)、谷胱甘肽 S - 转移酶(GSTs)活性增加 [7];玉米经烯草酮、环磺酮处理后其 POD、超氧化物歧化酶(SOD)活性增加 [8-9];灭草松也可提高水稻抗氧化酶和解毒酶的活性 [10-11]。此外，解毒酶 GSTs 及细胞色素 P450(CYP450)也参与了植物代谢抗性的产生。杨倩等 [12] 研究发现，稗出现抗性种群主要是因为 CYP450、谷胱甘肽转移酶(GST)介导的代谢增强。Pan 等 [13] 发现，CYP81A6 基因在水稻对除草剂甲磺隆和灭草松的代谢和耐受性中发挥了作用。毕亚玲等 [14] 研究发现，CYP450 家族成员基因 CYP76C1、CYP76C2、CYP76C4、CYP71C6V1、CYP72A31、CYP81A6、CYP81A12 和 CYP81A21 参与了植物对除草剂的代谢解毒作用。目前，植物对除草剂的代谢机理及耐药机制报道虽然较多，但有关蚕豆对除草剂灭草松的代谢机理及耐药机制鲜见报道，因此，本研究利用 RNA-Seq 转录组分析鉴定蚕豆对灭草松代谢过程中可能涉及到的重要基因，从分子水平研究蚕豆耐灭草松的作用机制，为灭草松耐性机理研究提供蚕豆数据，为耐除草剂蚕豆品种的遗传育种研究提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验材料及药剂

　　供试蚕豆品种：敏感品种‘小红蚕豆’(S)和耐药品种‘VF4’(R)，均由青海省农林科学院提供并经前期试验筛选所得。

　　供试除草剂：480 g/L 灭草松水剂(bentazon AS，批号 PD20152030)，由巴斯夫公司生产。

　　1.2 耐药基因挖掘试验

　　试验在青海大学温室中进行(光照 / 黑暗(L/D)：14.5 h/9.5 h;温度 15~20℃;相对湿度 20%~50%)。采用盆栽试验 [15]：待蚕豆催芽露白后种入直径 13 cm、高 13 cm 的花盆中，每盆播种 4 粒，将盆放入不锈钢方盘中，定时定量浇水。每个品种 30 盆。待蚕豆长至 3~5 叶期喷施 480 g/L 灭草松水剂，施用剂量为有效成分 2160g/hm²。根据前期预试验结果，确定于药后 0、3 d 取蚕豆自顶部第 3 片复叶，迅速放入液氮中置于 - 80℃冰箱中保存，备用。各样品均重复 3 次，试验 3 次重复，共 12 份样品，样品名称标记为耐药性品种：R0-1、R0-2、R0-3、R3-1、R3-2、R3-3，敏感性品种：S0-1、S0-2、S0-3、S3-1、S3-2、S3-3。

　　1.3 总 RNA 提取及文库构建

　　所采样品送至武汉迈特维尔生物科技有限公司提取 RNA，构建 cDNA 文库，并对其质量进行检测。库检合格后用 Illumina 平台进行测序。

　　1.4 转录组生物信息学分析

　　过滤原始数据(Raw Reads)，进行测序错误率检查及 GC 含量分布检查，得到后续分析使用的 Clean Reads。使用 HISAT2 [16] 将 Clean Reads 和参考基因组进行序列比对，获取在参考基因组或基因上的位置信息，以及测序样品特有的序列特征信息，利用 StringTie [17] 将序列组装成转录本，通过比较拼接的转录本与基因组注释的结果中提取新转录本信息，进行新基因发掘和功能注释。以 | log₂FoldChange|≥1 且 FDR<0.05 为条件，使用 DESeq2 [18-19] 进行差异基因筛选，分析样品组间的差异表达。利用 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)、Gene Ontology(GO)进行差异基因功能注释和富集分析。

　　1.5 实时定量 PCR 分析

　　使用 TRIzol 试剂从蚕豆叶中提取总 RNA，用 FastKing 第一链合成试剂盒合成 cDNA。根据转录组测序结果所得序列，利用 Primer Premier 5.0 软件随机选取 12 个差异表达基因，设计实时荧光定量(qRT-PCR)引物，以 FPKM(每千个碱基的转录每百万映射读取的 fragments)>50 且 | log₂FoldChange|≥1 为条件，进行差异表达基因筛选。按照 FastReal 快速荧光定量 PCR 预混试剂盒说明配制反应体系，反应程序为预变性，95℃，2 min;变性，95℃，5 s，40 个循环;退火 / 延伸，60℃，32 s。每个样本 3 次生物学重复和 3 次技术性重复，运用 2^(-△△CT) 进行结果分析。

　　2 结果与分析

　　2.1 测序数据质量评估

　　测序结果表明，Raw Reads 有 46892242~52525260 条，Clean Reads 有 46025006~51412088 条，碱基质量值 Q20 及 Q30 分别大于 98.08%、94.19%，G 和 C 碱基数量之和占总碱基数量的 42.70%~43.14%。将 Clean Reads 与参考基因组进行序列比对，发现能比对上参考基因组的 Reads 有 87.16%~95.22%，惟一比对上参考基因组的 Reads 有 89.05%~90.38%。

　　通过对基因的 FPKM(Fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments)相关性进行矩阵分析，发现 R0-1~R0-3 与 S0-1~S03、R3-1~R3-3 与 S3-1~S3-3 之间的相关系数均接近于 1，表明这些样品之间表达模式相似度较高。

　　2.2 差异表达基因筛选

　　每组比较组合的差异表达基因数目。R0 vs S0 组中共筛选到 7813 个差异表达基因，其中 4465 个上调基因，3348 个下调基因;S0 vs S3 组中共筛选到 6387 个差异表达基因，其中 3162 个上调基因，3225 个下调基因;R3 vs S3 组中共筛选到 5967 个差异表达基因，其中 3153 个上调基因，2814 个下调基因;R0 vs R3 组中共筛选到 8977 个差异表达基因，其中 4897 个上调基因，4080 个下调基因。结果表明，R0 vs S0、S0 vs S3、R3 vs S3 及 R0 vs S3 中共同差异表达基因有 512 个。

　　2.3 差异表达基因 GO、KEGG 富集分析

　　对 R0 vs S0、S0 vs S3、R0 vs R3 及 R3 vs S3 中共同的 512 个差异表达基因进行 GO 功能分类，其中生物过程(biological process，BP)涉及 909 个亚类，细胞组成(cellular component，CC)涉及 110 个亚类，分子功能(molecular function，MF)涉及 327 个亚类。取显著富集前 20 个条目绘制散点图，其中 7 个条目属于 BP，1 个条目属于 CC，12 个条目属于 MF，说明灭草松对蚕豆生物过程的影响大于对分子功能和细胞组成的影响。

　　进一步对 512 个差异表达基因进行 KEGG 注释分析，结果表明：在 KEGG 数据库注释到 90 条代谢通路，取显著富集前 20 条代谢通路绘制散点图，包含异喹啉类生物碱的生物合成、次生代谢产物的生物合成、酪氨酸代谢、黄酮类化合物的生物合成、植物 - 病原菌互作、异黄酮生物合成、过氧化物酶体、二萜生物合成等。

　　2.4 异黄酮生物合成代谢途径相关基因分析

　　根据 KEGG 数据库结果，发现许多基因参与了异黄酮生物合成代谢途径，包括 CYP450 家族基因(CYP71D9、CYP81E8)、丙二酰辅酶 A：花色素 5 - 葡萄糖苷 - 6″-O - 丙二酰基转移酶(MC5MAT1、MC5MAT2)、异黄酮 3'- 羟化酶(isoflavone 3'-hydroxylase)(IF3H)、羧酸酯酶(carboxlesterase，CXE)(CXE12、CXE6)。经灭草松处理后，上述这些基因表达量水平在耐药蚕豆内均上调，且高于敏感蚕豆，其中 CYP71D9、CPY81E8、CXE6 在 R3 中表达量分别是 R0 的 3.61、3.63、4.30 倍，CYP71D9、MC5MAT1、MC5MAT2 在耐药蚕豆中的表达量分别是敏感蚕豆的 1.20、2.87、1.98 倍。

　　2.5 其他代谢途径相关基因分析

　　对过氧化物酶体、二萜生物合成、谷胱甘肽代谢、次生代谢产物的生物合成 4 个代谢途径相关基因进行分析，包括过氧化物酶体 2,4 - 二烯酰辅酶 A 还原酶(PODDCR)、过氧化物酶体酰基辅酶 A 氧化酶(PODACAO1)、贝壳杉烯酸氧化酶(KAO2)、CYP450(CYP82G1)、赤霉素 20 氧化酶(GA201-D)、GST(GST23)、GSTs(GSTsF9)、核酮糖二磷酸羧化酶小亚基(RbcS)、核酮糖 1,5 二磷酸羧化酶(ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase，Rubisco)(Rbc)。经灭草松处理后，PODDCR、KAO2、CYP82G1、GA201-D、GST23、GSTs、GSTsF9 表达量水平在耐药蚕豆内均上调，其中 CYP82G1、GA201-D 在 R3 中表达量分别是 R0 的 5.44、4.24 倍，在耐药蚕豆内表达量分别是敏感蚕豆的 2.09、1.65 倍;PODACAO1、RbcS、Rbc 在耐药蚕豆、敏感蚕豆内表达量下调，在耐药蚕豆内表达量分别是敏感蚕豆的 1.19、0.74、1.38 倍。

　　2.6 转录组 qRT-PCR 验证

　　为验证 RNA-Seq 结果的准确性，随机选取 12 个差异表达基因进行 qRT-PCR 试验。结果表明：灭草松处理 3 d 后，VFH_I004120、VFH_III198400、VFH_II021000、VFH_I442000、VFH_III064560、VFH_II050640、VFH_IV205840 在耐药蚕豆及敏感蚕豆中表达量较处理 0 d 均降低，VFH_I346520、VFH_V173200、VFH_II118760、VFH_I073840、VFH_II035080 在耐药蚕豆及敏感蚕豆中表达量较处理 0 d 均增加，与 RNA-seq 测序结果变化趋势一致，证明转录组测序结果可靠。

　　3 讨论

　　通过对不同生长环境和不同发育时期样本之间的基因差异表达进行对比，可有效揭示特定分子机制 [20]。本研究中，对灭草松处理 0 d 及 3 d 耐药蚕豆及敏感蚕豆叶片的转录组测序结果进行比较分析，发现 R0 vs R3 组的差异表达基因是 S0 vs S3 组的 1.40 倍，与 Liu 等 [21] 研究结果不同，推测可能是因为耐药蚕豆为抵御灭草松造成的损伤，诱导了更多基因的差异表达。本研究使用韦恩图分析，获得了 512 个与蚕豆耐灭草松机制相关的差异表达基因，这些基因均被灭草松诱导表达，且在耐药蚕豆和敏感蚕豆中的表达存在差异。GO 富集分析结果表明，灭草松对蚕豆的生物过程影响较大。KEGG 富集分析结果表明，这 512 个差异表达基因显著富集在异黄酮生物合成、过氧化物酶体、二萜生物合成等代谢途径上，说明蚕豆对灭草松的胁迫做出了应答。

　　异黄酮、花青素等类黄酮化合物广泛存在于植物的各个组织部位中 [22]，它们能在植物抵御环境胁迫及其他生物之间的互作时发挥重要作用 [23]。异黄酮作为豆科植物生长过程中积累的一类次生代谢产物 [24]，是植保素大豆抗毒素的主要来源，在豆科作物抗胁迫中发挥重要作用 [25]。研究表明 [26-27]，大豆、灰皮黑豆在大豆胞囊线虫胁迫下可诱导异黄酮关键酶表达。花青素酰基转移酶(包括丙二酰基转移酶)主要参与多酚类化合物的酰基化结构修饰 [28]，酰基化的花青素可提高稳定性、显色性及抗氧化活性 [29]。本研究中，经灭草松处理后，IF3H、MC5MAT1、MC5MAT2 基因在耐药蚕豆、敏感蚕豆中均表达上调，且在耐药蚕豆内表达量高于敏感蚕豆，推测这 3 个基因参与了蚕豆对灭草松的代谢过程。说明蚕豆在灭草松胁迫下，诱导了类黄酮中异黄酮及花青素相关酶基因表达，这增加了蚕豆抵御除草剂胁迫的能力及抗氧化活性，且耐药蚕豆内基因表达量高于敏感蚕豆，推测类黄酮在蚕豆耐灭草松机制上起着重要作用。

　　CXE 广泛存在于动植物及微生物中，可调控除草剂活性、响应植物生物胁迫及活化植物激素信号物质 [30]。在大穗看麦娘 [31] 中发现了一个可以水解芳氧苯氧丙酸酯类活性的 CXE 蛋白(Am GDSH1)，在拟南芥 [32] 中鉴定出一个丝氨酸蛋白酶(At CXE12)，可水解除草剂前体甲基 - 2,4 - 二氯苯氧乙酸。本研究中，经灭草松处理后，耐药蚕豆内 CXE6 在耐药蚕豆、敏感蚕豆中表达上调，CXE12 在耐药蚕豆中表达上调，在敏感蚕豆中表达下调。推测耐药蚕豆内 CXE6、CXE12 两个基因参与了代谢过程，对灭草松毒素具有解毒作用;敏感蚕豆内只有 CXE6 参与了代谢过程，而 CXE12 基因受到抑制。

　　在植物的抗氧化系统中，POD 等抗氧化酶能够相互协调清除植物细胞在逆境(除草剂)胁迫下产生的过量活性氧，维持植株的正常代谢水平，避免受到伤害 [33]。POD 在植物体中负责清除由逆境产生及超氧化物歧化酶作用产生的过量 H₂O₂[34]。本研究中，经灭草松处理后，POD 代谢通路中的 PODDCR 表达上调、且在耐药蚕豆内表达量高于敏感蚕豆，这与 Matzrafi 等 [35]、赵铂锤 [36] 研究结果一致。而 PODACAO1 受到抑制表达下调，推测因为 PODDCR 表达上调导致蚕豆对灭草松产生了代谢抗药性，PODACAO1 与蚕豆耐灭草松机制无关。

　　植物非靶标抗性产生主要是因为除草剂代谢率的提高 [37]，其关键酶系包含 CYP450、GSTs，两者均为多功能重要酶系，可使植物获得除草剂抗性和选择性 [38-39]。本研究中，经灭草松处理后，GST23、GSTs、GSTsF9 在耐药蚕豆中均上调表达，说明这 3 个基因参与了耐药蚕豆对灭草松的代谢过程，与蚕豆耐灭草松机制有关。CYP71D9、CYP81E8、CYP82G1 及 CYP88A 亚家族基因 KAO2 在耐药蚕豆、敏感蚕豆中上调表达，且在耐药蚕豆中表达量高于在敏感蚕豆中的，说明 CYP450 家族基因在蚕豆代谢灭草松过程中发挥了重要作用，参与了蚕豆对除草剂的代谢解毒过程。蚕豆耐灭草松机制与 GSTs(GST23、GSTs、GSTsF9)和 CYP450 酶系(CYP71D9、CPY81E8、CYP82G1 及 KAO2)密切相关。

　　Rubisco 是光合作用碳吸收的主要酶，其活性在调节光合作用中起着重要作用，也是决定净光合速率最重要的因素 [40]。在高温 [41]、低温弱光 [42]、臭氧 [43] 胁迫下，植物体内 Rubisco 活性会受到抑制。本研究中，施用灭草松后，耐药蚕豆、敏感蚕豆体内 RbcS、Rbc 两个基因表达均受到抑制，表明灭草松破坏了蚕豆叶片的叶绿体，从而影响了碳吸收。相对于耐药蚕豆，灭草松对敏感蚕豆中 RbcS、Rbc 的抑制程度更大，猜测灭草松对敏感蚕豆的叶绿体破坏程度大于耐药蚕豆，这可能是蚕豆表现出敏感的原因。

　　本研究利用 RNA-Seq 技术对灭草松处理后耐药蚕豆、敏感蚕豆的转录组进行测序分析，初步探究了与蚕豆耐灭草松机制可能相关的基因，包括 CYP71D9、CYP81E8、MC5MAT1、MC5MAT2、IF3H、CXE12、CXE6、PODDCR、KAO2、CYP82G1、GA201-D、GST23、GSTs、GSTsF9。本研究结果可为蚕豆对灭草松非靶标抗性机理及蚕豆遗传育种提供理论基础。

蔡青;翁华,贵州省铜仁市万山区鱼塘侗族苗族乡农业农村综合服务中心;青海大学农林科学院,202501