力学进展杂志投稿格式参考范文：细胞核生物力学研究进展

　　为更深入地认识生理和病理状态下细胞核的力学特性，揭示其在细胞命运决定中的作用和机制，本文总结了细胞核生物力学相关的研究进展，重点介绍了细胞核骨架、核孔复合体和染色质的物理结构、力学响应过程、各组分的相互作用以及用于细胞核生物力学研究的技术进展，最后总结了细胞核与早衰综合症、神经退行性疾病和心血管疾病的关系，并对细胞核生物力学未来发展进行了展望。

　　1 引言

　　作为真核细胞的标志，细胞核是遗传物质储存、复制和基因转录发生的中心，也是细胞响应外界物理、化学刺激的重要细胞器。细胞核直径约为 5~15μm，被两层磷脂双分子膜组成的核膜所包裹，在空间上将遗传物质和细胞质分隔开来，形成核内特殊的微环境。根据其位置不同，核膜分为胞质侧的外核膜(outer nuclear membrane, ONM)与核质侧的内核膜(inner nuclear membrane, INM)，两层核膜间具有 20~50nm 的间隙。ONM 向胞质侧与内质网连通，向核质侧与 INM 融合;在 INM 与 ONM 的融合处嵌入核孔复合体(nuclear pore complex, NPC)，通过其中央的环形通道介导了胞质与核内物质的选择性交换。

　　细胞核内贴近 INM 处分布着致密的核骨架蛋白纤维网−核纤层，是维持细胞核刚度的主要结构。细胞核膜上还存在跨越 ONM 和 INM 的细胞核 - 细胞骨架连接(linker of nucleus and cytoskeleton, LINC)复合体，该复合体由含有 KASH(Klarsicht, ANC-1 and Syne homology)结构域蛋白的 Nesprin(nuclear envelope spectrin repeat protein)和 SUN(Sad1-UNC84 homology)两类蛋白组成。LINC 复合体在物理结构上连接了细胞骨架和细胞核，将细胞外的力学刺激经由细胞骨架传递至核内，进而影响染色质定位和基因表达。

　　细胞内机械力沿细胞骨架 - LINC 复合体传递的速度远快于生物化学信号传递的速度。施加在细胞膜表面的机械力沿着细胞骨架以约 30m/s 的速度传播，而细胞质中通过扩散作用移动的小分子物质(如钙离子)的移动速度约为 2μm/s，细胞质中基于马达转运机制运输的生物大分子，移动速度仅为 1μm/s。相比之下，传递 50μm(近似于从细胞膜到细胞核表面)，钙离子等小分子扩散需 25s，基于分子马达运输需 50s，而机械应力沿细胞骨架传递仅需 2μs。因此，细胞外机械力不仅可以激活细胞膜上 Piezo、整合素(Integrin)等力学感受器开启细胞内级联的生化事件，还可以通过细胞骨架 - LINC 复合体 - 核纤层这一系列物理连接结构直接被传递入细胞核，迅速地将物理信号转化为核内生物事件。

　　细胞核是细胞中最硬的细胞器，其弹性模量约为 5000N/m²，是细胞质的 2~10 倍;细胞核也表现出一定的黏性特征，其黏性约为细胞质的 2 倍。对游离细胞核的体外拉伸实验表明，在 < 30% 的形变范围内细胞核对外力的抵抗由染色质主导，而对较大形变的抵抗则由核纤层蛋白 Lamin A/C 主导。对于低变形状态的细胞核而言，染色质组蛋白修饰状态和组成是决定细胞核力学性质的主要因素。通过使用组蛋白去乙酰化酶抑制剂增加常染色质、使用组蛋白甲基转移酶抑制剂减少异染色质或者干扰连接体组蛋白 H1，均导致细胞核变软和更多的细胞核出泡事件。

　　撤去外力后，拉伸的细胞核以黏弹性的方式松弛，并表现出一定的延迟效应。例如，Neelam 等应用微吸管技术以 6nN 的吸力拉伸细胞核发现，撤销吸力后形变的细胞核约 1.7s 后恢复至初始形状，体现了细胞核的黏弹性特征。这种黏弹性特征的维持需要核纤层、LINC 复合体、染色质等核内组分的参与。新的证据还提示，染色质和核膜之间通过形成一个相互连接的网络进一步增加细胞核刚度。细胞核的力学特性由核纤层蛋白、染色质和其他核成分之间的复杂耦合关系决定，而数值随检测方式、施加力的大小或被检测成分的变化而变化。

　　此外，由于细胞骨架与核骨架之间的密切联系与相互连接，胞质内各组分对细胞核力学特性的贡献也并非单一存在。例如，细胞骨架紊乱、细胞骨架与核骨架解耦，可导致细胞核硬度改变以及细胞核不能对应力 / 应变做出适当响应。

　　细胞核的结构、组装和力学特性对于细胞功能至关重要，如影响细胞的基因表达、分裂分化过程和疾病的进展。在临床诊断方面，细胞核结构的异常已逐渐成为癌症诊断 “金标准” 之一，包括细胞核形态大小的变化、核仁大小和数量的变化以及染色质形态等。因此，细胞核在机械信号转导和细胞功能调控中的作用日益引起研究者的重视。本文主要介绍了细胞核内 3 种主要组分−细胞核骨架、NPC 和染色质的组成结构以及在生物力学领域的相关研究进展，进而关注各组分在力学刺激响应过程中的相互作用，同时总结了用于表征细胞核生物力学特性的技术进展，并对与细胞核相关的疾病进行了介绍，最后讨论了细胞核生物力学研究的挑战与前景，以期为从生物力学交叉的视角理解机体生理功能、揭示疾病发生发展新机制和寻找临床转化新靶点提供启示。

　　2 细胞核骨架与生物力学

　　细胞核骨架是位于细胞核内的蛋白网架体系，包括跨核膜的 LINC 复合体、位于核浆内的致密网状核纤层及相关蛋白。细胞核骨架不仅为细胞核提供稳定的力学支撑，而且在细胞机械信号转导、基因转录调控中也具有重要作用。本章对细胞核骨架蛋白的主要组分 Nesprin、SUN、Emerin 和 Lamins 进行概述，并对其力学特性和参与的机械信号转导过程进行介绍。

　　2.1 细胞核骨架蛋白概述

　　2.1.1 Nesprin 家族

　　Nesprin 蛋白锚定于 ONM，是 LINC 复合体中的重要组分之一，包含 Nesprin1、Nesprin2、Nesprin3 和 Nesprin4 共 4 种亚型，在结构上均含有长度可变的骨架蛋白重复序列(spectrin repeat, SR)和 C 末端高度保守的 KASH 跨膜结构域。

　　Nesprin1 又称 Syne-1、Enaptin 或 Myne-1，是在寻找血管平滑肌细胞收缩表型特异性分化标记物的过程中发现的，也是首个被确认的 Nesprin 蛋白，其特征是存在多个成簇的血影蛋白重复域、2 个核定位序列(nuclear localization signal, NLS)和一个保守的 C 端单一跨膜结构域，在平滑肌和心肌细胞的 ONM 上高表达。

　　Nesprin2 又称 Syne-2 或 NUANCE，其序列与 Nesprin1 有 60% 以上的同源性，在多种细胞的 ONM 表达，并且有少部分存在于核浆中。Nesprin1 和 Nesprin2 的 N 端均包含能与细胞骨架 F-actin 结合的钙结合蛋白同源结构域(calponin homology domains, CHD)，而 Nesprin3 和 Nesprin4 不包含 CHD 结构域。

　　Nesprin 的 4 种亚型与细胞骨架蛋白的结合能力和方式不同。Nesprin1 和 Nesprin2 通过 N 端 CHD 结构域与细胞骨架 F-actin 直接结合;Nesprin3 通过衔接蛋白 Plectin 与中间丝相互作用;Nesprin1、Nesprin2 和 Nesprin4 分别通过马达驱动蛋白 Kinesin 和 Dynein 与微管相互作用。此外，4 种 Nesprin 亚型 C 端的 KASH 结构域在 ONM 和 INM 的间隙中与 SUN 结构域相互作用。通过上述连接结构，位于 ONM 的 Nesprin 蛋白将胞浆中的细胞骨架与细胞核紧密连接在一起。

　　2.1.2 SUN 家族

　　SUN 蛋白又称 Sad1/UNC-84 蛋白，是一种广泛分布于酵母、线虫等真核生物的膜蛋白，主要定位于 INM 以及内质网。由于在酵母中发现 SAD1 突变后会影响纺锤丝的形成与功能，现象与线虫中 UNC-84 突变的表型相似，并且两种基因编码蛋白的 C 端有近一半的序列同源，因此将 Sad1 蛋白与 UNC-84 蛋白名称结合而得名 SUN 结构域。此后发现，包含 SUN 结构域的同源蛋白在真核生物中广泛存在且高度保守，如酵母的 Sad-1、线虫的 UNC-84 和 SUN1、果蝇的 Klaroid 和 Dm、动植物细胞内的 SUN1 和 SUN2 等同源蛋白。

　　到目前为止，已被确认的哺乳动物 SUN 蛋白有 5 种，包括 SUN1、SUN2、SUN3、SPAG4 和 SUN5。其中，SUN1 和 SUN2 蛋白是哺乳动物中最先被确认的 SUN 蛋白家族成员，具有保守的 SUN 功能结构域，并在体内广泛表达，而 SUN3、SPAG4 和 SUN5 仅在睾丸中表达。

　　SUN1 和 SUN2 均为 Ⅱ 型跨膜蛋白，在核膜间隙内 SUN 结构域与 Nesprin1 和 Nesprin2 蛋白的 KASH 结构域形成稳定的物理连接。SUN 蛋白在调节细胞核的胞内迁移和锚定、DNA 损伤修复等过程中发挥着重要的作用。最近的研究结果表明，抑制 SUN2 的表达，可以有效减少机械牵张引起的细胞骨架 - 细胞核解偶联和细胞核软化，从而增加核的可变形性，提示 SUN2 通过调节细胞核力学特性在应力诱导的细胞核损伤中发挥重要作用。

　　2.1.3 Lamins 蛋白

　　Lamins 属于第 V 类中间纤维(type V intermediate filament)，位于 INM 下方并构成核周的致密蛋白纤维网络结构，为细胞核结构提供了稳定支撑。组成核纤层的蛋白主要包括 A 型(Lamin A 和 Lamin C)和 B 型(Lamin B1 和 Lamin B2)。Lamin B1 和 Lamin B2 分别由 LMNB1 和 LMNB2 基因编码，在所有哺乳动物细胞类型中普遍表达;Lamin A 和 Lamin C 均由 LMNA 基因编码，是 LMNA 基因选择性剪接的产物。

　　Lamins 的基本结构较为相似，主要包括 N - 端的头部、双螺旋中心结构、NLS 序列以及 Ig 折叠结构域(Immunoglobulin (Ig)-fold domain)的 C - 端尾部。Lamins 蛋白与 SUN 蛋白之间存在相互作用，从而将 LINC 复合物锚定到核纤层。

　　真核细胞胞质内的中间纤维(包括 Keratin 纤维、Vimentin 纤维、结蛋白纤维、神经纤维)往往首先形成同向二聚体，随后形成反向错位四聚体，四聚体再次螺旋缠绕形成 10nm 纤维束。而核骨架蛋白 Lamins 形成直径 3.5nm 左右的四聚体纤维束，与典型的中间纤维的形成方式存在差异。虽然在体外 Lamin A/C 可形成异源二聚体，但在体内只形成同源二聚体。

　　原子力显微镜(atomic force microscope, AFM)研究表明，Lamins 在较低拉伸力(<500pN)下发生可逆形变;随后在较大拉伸力下过渡到非线性应变硬化状态，并在大于 2nN 的力下发生断裂。在拉伸力低的状态下，形变的可逆性可能是由于 Lamins 中 α 螺旋圈的展开引起的;而在拉伸力较大的条件下，纤丝的应变增强则是由于 α 螺旋向 β 折叠的结构转变引起。该研究进一步表明，Lamins 蛋白可承受高达 2.5 倍的变形，这一数据与其他类型的中间纤维相当。

　　通过对 Lamins 蛋白的重复施力测量其滞后能，实验表明 Lamins 蛋白在承受不同压缩力时具有显著的吸收能量的能力。因此，Lamins 蛋白具有显著高于弹性蛋白(2MJ m⁻³)、肌腱胶原蛋白(7.5MJ m⁻³)或碳纤维(25MJ m⁻³)的拉伸韧性，其韧性值约为 147MJ m⁻³，与羊毛、尼龙和蚕丝(60~150MJ m⁻³)相当。Lamins 蛋白独特的柔韧性使其成为维持细胞核刚度和完整性的核心要素，是保护基因组的最佳材料。

　　由 Lamins 形成的四聚体纤维束也存在细微差别，Lamin A/C 形成的网络致密，而 Lamin B 形成的网络存在较大间隙，当 Lamin B 缺乏时，细胞核呈现出泡结构。Bruce Nmezi 研究表明，Lamin A/C 和 Lamin B 形成互相独立的网络，分布于不同层面，Lamin B 紧贴 INM，而 Lamin A/C 位于其下侧靠近核质，这种差异是由于 Lamin B 末端修饰的法尼基与 INM 互作引起的。Lamin A/C 作为细胞核中密度最高、机械强度最大的中间纤维，表达水平和组装状态是决定核硬度和黏弹性的最关键分子。

　　研究显示，Lamins 不仅在维持细胞核结构和稳定性方面具有重要作用，同时还能直接或间接调控基因转录，参与核内 DNA 复制、基因表达和染色体构建等一系列核功能调控，并在癌症、心肌和骨骼肌疾病中发挥关键作用。

　　2.1.4 Emerin 蛋白

　　Emerin 是一种由 EMD 基因编码的 Ⅱ 型膜蛋白，其 N 端位于核浆，有 1 个包含 43 个氨基酸残基的球状结构域，该结构域在维持 Emerin 稳定性中具有重要作用。Emerin 蛋白有多种结合蛋白，不仅能与 Lamin A、SUN1、SUN2 和 Nesprin1 蛋白结合，还能与转录因子 BAF、GCL、Btf、Lmo7 和 β-catenin 等结合。

　　研究发现，Lamin A 与染色质的相互作用是基于 Emerin 实现的，Emerin 可以阻止染色体上有丝分裂末期 BAF 介导的 Lamin A 异常聚集，从而允许核膜扩张和核纤层的正常形成。Guilluy 等的研究结果显示，对游离细胞核直接施加机械刺激引起的细胞核形态变化，能够调控 Emerin 和 Lamin A 表达、分布和磷酸化。

　　虽然 Emerin 广泛表达在人体的各个组织，但其突变引起的 Emery–Dreifuss 肌营养不良(Emery–Dreifuss muscular dystrophy, EDMD)显示出组织特异性表型，主要导致肘部、颈部和跟腱的挛缩，并逐渐发展为骨骼肌的萎缩，最严重者会由于心肌传导系统缺陷导致心跳停止。

　　Emerin 缺失引起 EDMD 疾病的机制并不完全清楚，推测可能是由于其磷酸化异常导致的功能改变。例如，临床数据显示，大量患有 EDMD 病人体内 Emerin 蛋白发生磷酸化修饰的第 59 位酪氨酸(Tyr59)位点均有缺失，而 Tyr59 位点的磷酸化能抑制转录因子 GCL、Btf、Lmo7 与 Emerin 的结合，并影响其各自的靶基因。

　　2.2 细胞核骨架与机械信号转导

　　由 LINC 复合体、核纤层及相关蛋白构成的细胞核骨架作为贯穿双层核膜、为细胞核提供稳定力学支撑的重要结构，在感受细胞外机械刺激和调控基因转录中发挥重要作用，是目前生物力学研究的热点之一。

　　Guilluy 等的研究为细胞核通过细胞核骨架蛋白直接感受应力 / 应变刺激提供了重要的证据，应用 Nesprin-1 抗体包被的磁珠对 Hela 细胞分离出的细胞核直接施加应力刺激，在引起细胞核形态变化的同时迅速通过 Src 激酶引起核骨架蛋白 Emerin 酪氨酸磷酸化，调控核自身刚度变化。

　　Tajik 等应用 3D 磁扭转细胞术对单个活细胞施加牵张应力，可迅速上调特定基因转录，该过程不依赖于胞浆内信号转导，但依赖于细胞骨架和跨核膜的 LINC 复合体，而打断 LINC - 核纤层结构诱导细胞骨架 - 细胞核解偶联，在引起细胞骨架排列异常的同时，还能够引起细胞核结构和硬度异常以及 DNA 损伤。上述研究有力地证实了应力 / 应变力学刺激可以通过细胞骨架 - LINC 复合体 - 核纤层这一系列物理连接结构，直接传递入细胞核，迅速地将物理信号转化为核内生物化学信号。

　　目前，关于 Lamins 蛋白如何调控细胞功能存在 2 种假说。其中，基因调控假说认为，异常的 Lamins 蛋白可能通过对细胞核内表观遗传、转录调控和信号通路的激活或沉默统筹细胞活动;而结构假说则认为 Lamins 蛋白的表达变化可影响细胞核的刚度、韧性等力学参数，从而改变细胞核的力学敏感性。两种假说相互独立，且互为补充。例如，Lamins 蛋白异构体的缺失或敲低使小鼠胚胎成纤维细胞的核硬度由 15pN/μm 下降至 6pN/μm，并降低了表观遗传关键分子 H3K9me3 和 H3K27me3 水平。

　　值得注意的是，除了蛋白质表达水平变化外，Lamins 蛋白还存在复杂的剪切成熟和翻译后修饰变化。在 LaminA 蛋白成熟过程中至少包含 C 端 Cys-Ser-Ile-Met 氨基酸序列 Cys 巯基的法尼基化修饰，Cys 甲基化和 CAAX 异戊二烯蛋白酶(Zmpste24)切割 C 端 15 个氨基酸 3 个步骤，而成熟后的 LaminA 除形成经典的 INM 下致密蛋白纤维网架外，在多种激酶作用下发生可逆性磷酸化修饰进而溶解形成核浆内的游离态 Lamin A 单体。

　　Lamin A的聚集和溶解状态转换受其磷酸化状态调控，未磷酸化的 Lamin A 形成核纤层纤维蛋白网络存在于 INM 下层，以响应外部张力或收缩力，进而增加核硬度，而磷酸化的 Lamin A 溶解并分布于核浆内。已有研究显示，基质刚度等细胞外力学环境变化可以调控细胞 Lamin A 第 22 位丝氨酸(Ser22)的可逆性磷酸化修饰。

　　细胞收缩力与 Lamin A/C 的磷酸化状态之间存在反比关系，例如在软基质上培养的细胞中，细胞骨架收缩力降低会增加 Lamin A/C 的磷酸化，导致蛋白质溶解度增加。在对细胞核施加剪切应力的研究中发现，Lamin A/C 的 Ig 结构域中一个隐蔽的半胱氨酸残基的可及性增加，而在没有剪切应力的情况下该残基的可及性要低得多，提示细胞核骨架张力的增加也会导致 Lamin A/C 结构的改变，降低细胞核基底侧的特异性 Lamin A/C 表位的可及性。

　　除此之外，通过细胞核骨架传递的力会直接作用于染色质，特别是染色质核纤层相关结构域(lamina-associated domains, LADs)，在真核生物基因组中，与核纤层接触的区域被定义为 LADs。力学作用导致的 Lamin A/C 变化诱导染色质空间 / 时间动力学的改变，这一相互作用将在后续章节中进一步讨论。

　　综上所述，2 类核骨架蛋白 Lamins 蛋白和 LINC 复合物的相互作用在细胞核力学特性调控和机械信号转导中发挥重要作用，决定了细胞外力学信号如何影响细胞的行为和命运。Lamins 蛋白感受应力 / 应变刺激后，可能通过自身表达、翻译后修饰和结构变化直接调控核内染色质分布和基因转录，而 Lamins 异常也损害 LINC 复合体的结构与功能，引起细胞骨架 - 核骨架解偶联，进而导致机械信号转导缺陷和下游染色质功能障碍，参与早衰、肿瘤转移等疾病发生发展。进一步深入系统地研究特定核骨架蛋白在细胞核力学特性、机械力传递和应力信号级联传导中的作用，可能有助于开发与核骨架蛋白相关的疾病精准诊断、再生修复和靶向治疗新方法。

　　2.3 核内肌动蛋白 actin 概述

　　除上述细胞核骨架蛋白外，细胞核的结构和功能维持还离不开核内 actin 的参与。actin 作为真核细胞中含量丰富且高度保守的蛋白质之一，最初发现于兔子的骨骼肌中，后来的研究表明 actin 也是非肌肉细胞的重要组成部分。actin 是一种关键的细胞骨架蛋白，在细胞质中常以聚合形式存在并参与细胞的形态维持、细胞运动、内质网运输等多种细胞力学过程。

　　以往的研究主要集中在揭示细胞质 actin 的结构和功能，虽然早在 20 世纪 60 年代就有研究对细胞核中的 actin 进行了描述，但直到 21 世纪初，核内 actin 结构及其在调节真核细胞结构、功能、稳态等方面的重要性才逐渐引起研究者重视。

　　长期以来研究人员认为核内 actin 仅以单体的 G-actin 形式存在，但现有的研究已确定细胞质和细胞核内 actin 的组成和结构是相似的，都是由 G-actin 单体及其动态组装的 F-actin 构成，其中核内 F-actin 组装对于细胞核形态维持等事件具有重要作用。例如，非洲爪蟾卵母细胞具有较大的细胞核，需要核内 F-actin 的额外支持来稳定核结构。

　　细胞核内 actin 的可视化研究进一步支持了其可以组装成丝的观点。Baarlink 等使用了一种带有 NLS 序列的 Lifeact 探针(该探针是源于出芽酵母蛋白 Abp140 的小肽探针，可结合 G-actin 和 F-actin)，首次证明了血清诱导的 actin 蛋白在细胞核内的组装。细胞质和细胞核内 actin 结构的不同之处在于，核内 F-actin 不会形成长的丝状结构而是多以寡聚丝的形式存在，这可能是为了防止过长的 F-actin 干扰染色质而抑制转录等过程。

　　近年来，核内 actin 聚合在 DNA 损伤应答中的作用受到广泛关注。Mullins 团队证明了核内 F-actin 的形成参与了 DNA 损伤的核内氧化过程。另一项研究表明，磷脂酰肌醇在 DNA 损伤位点聚集并募集 formin 蛋白 mDia2 进而促进核内 F-actin 组装，介导 DNA 修复蛋白 ATR 定位到损伤部位。Gautier 团队的研究表明，Arp2/3 复合体也参与核内 actin 的聚合过程，而 F-actin 是受损染色质进行同源定向修复所需的。这些研究表明，核内 actin 的聚合对于 DNA 损伤应答过程是十分必要的。

　　此外，核内 actin 转录调节中具有重要功能。在体外实验中，Actin 蛋白组分可增加 RNA 聚合酶 II 的活性，提示核内 actin 是形成转录起始复合物的必要条件。Wei 等证明细胞核内 N-WASP/Arp2/3 诱导 actin 的从头聚合，促进 RNA 聚合酶 II 复合体的形成，提示核内 actin 聚合在转录调节过程中发挥作用。此外，在血清刺激下核内 G-actin 迅速形成 F-actin 网络，促进了 MRTF-A 转录因子的核内滞留，从而响应血清反应因子调节转录。

　　目前，已经明确核内 actin 参与 DNA 损伤应答、转录调控等重要的核内生物过程，但具体机制仍有待深入研究。并且 actin 不断穿梭于细胞核内外，细胞质与细胞核之间 actin 的平衡受到严格调控，但其调控机制尚不清楚。

　　3 NPC 与生物力学

　　NPC 是真核细胞细胞质与细胞核之间物质选择性交换的精密纳米通道，介导了离子和大分子物质快速和高选择性的核 - 质双向运输，尤其在分子量大于 50 kDa 生物大分子进出细胞核过程中起到至关重要的作用。迄今为止，NPC 复杂而微妙的几何结构以及核 - 质运输的精细时空分辨率解析仍然存在巨大研究空白。研究人员应用连续介质力学、粗粒度布朗动力学、分子动力学、统计热力学以及生物信息学等方法在 NPC 的结构和功能以及核质物质运输的动力学等方面进行了探索。本章对 NPC 的基本结构进行概括，重点介绍 NPC 主导的核 - 质物质转运过程以及 NPC 在机械信号转导过程中的作用。

　　3.1 NPC 的基本结构

　　NPC 是镶嵌在 ONM 和 INM 融合处的大型蛋白复合体。每个 NPC 由约 30 种核孔蛋白(Nups)以多拷贝的形式组成，总蛋白数约 500~1000 个，总分子量约为 110 MDa，这使得 NPC 成为细胞中最大的组装复合体。核孔蛋白在 NPC 中组成亚复合体，具体分为结构支架、中央通道、细胞质丝和核篮。

　　NPC 结构支架核心包括内环和外环，它们通过跨膜核孔蛋白锚定在核膜上，并为中央通道、细胞质丝和核篮提供结构支撑。所有的 NPCs 亚复合体的核孔蛋白组成成分高度保守：结构支架中的外环主要包含 Elys、Nup37、Nup43、Nup85、Nup96、Nup107、Nup133、Nup160、Sec13 和 Seh1;内环包含 Nup35、Nup93、Nup155、Nup188 和 Nup205;中央通道包含 Nup54、Nup58、Nup62 和 Nup98;胞质丝包含 Nup88、Nup214 和 Nup358;核篮包含 Nup50、Nup153 和 Tpr。

　　3.1.1 结构支架

　　结构支架由 8 个相同的辐条(spoke)构成，它们围绕 NPC 的中轴旋转对称排列，这一结构使每个辐条的弯曲刚度最大化，并稳定整个支架，防止结构扭曲变形。辐条呈放射状连接形成平行于 NPC 赤道面的同心圆亚复合体，包括 4 个同轴的环状结构：2 个外环分为位于胞质侧的外环(cytoplasmic ring)和核质侧的核环(Nuclear ring)，位于 2 个外环之间的内环(inner ring)，以及穿插于双层核膜内部的腔环(lumen ring)。

　　内环是结构支架中结构最保守的单元，其组成蛋白由 N 端 α 螺旋或 β 螺旋、C 端 α 螺旋组合而成，这为内环结构的灵活性和可变性提供了基础。内环直径随细胞能量状态的改变在 40~60 nm 范围内变化。研究显示，在细胞能量耗尽和高渗透压条件下，细胞核体积减小，核膜张力降低，NPC 内环直径收缩至 40 nm。内环中央通道侧，为富含苯丙氨酸(F)和甘氨酸(G)结构域(FG)的核孔蛋白提供了结合位点，游离于中央通道的 FG 基序构成了大分子通过 NPC 的重要选择性屏障。NPC 通过腔环与核膜的结合，这一结合是通过插入细胞核磷脂双层膜的两亲性短氨基酸序列(Membrane-binding motifs, MBMs)介导的。

　　外环的大小和构象在不同物种之间存在显著差异，酵母 NPC 的外环直径约为 98 nm，而人类的外环直径约为 120 nm。如前所述，外环分别存在于核质和胞质侧，分别连接核篮和细胞质丝。外环通过 MBMs 与核膜相连，并调节 ONM 和 INM 融合处的膜曲率。外环的核心结构为 Y 复合物，主要由 α 螺旋和 β 螺旋这两种结构域构成，8 个 Y 复合物头尾排列形成环状结构。这些环状亚复合体通过由部分核孔蛋白内在无序结构域构成的短线性基序网络(short linear motifs, SLiMs)连接在一起。虽然单一 SLiMs 介导的相互作用较弱，但多重的相互作用也赋予了结构支架灵活性和完整性。

　　3.1.2 中央通道

　　中央通道是由结构支架包围的直径为 40~60 nm 的管道，分子通过中央通道进行核 - 质转运和扩散。富含 FG 基序的核孔蛋白一端与结构支架相连接，另一端充满中央通道在通道内自由摆动。无序的 FG - 核孔蛋白形成 NPC 选择性屏障，允许特定的转运蛋白通过。

　　在 NPC 中有 200~300 个含 FG 基序的核孔蛋白，它们共同形成了转运体结构。由于 FG - 核孔蛋白的展开特性，它的整体形状和内部密度会随着时间的推移而改变。转运体有 “开放” 和 “关闭” 两种构型状态，在这两种状态下，FG - 核孔蛋白分别聚集在通道壁附近或通道中心轴周围。转运体通过热波动完成不同构象间的切换，并选择性地允许分子通过中央通道。

　　FG - 核孔蛋白长度约为 0.43 nm，表现为具有高度柔韧性的聚合物，其柔性在调节选择性分子运输时起着关键作用。FG 基序本身是疏水的，可与核转运受体(nuclear transport receptors, NTRs)产生疏水相互作用，但 FG 基序间隔区的存在可防止其相互聚集，有助于保持结构的无序性。虽然 NTR 每个结合口袋和 FG 基序之间的亲和力较小，但由于相互作用位点和 FG 基序的多价性，可使它们的总体亲和力增加 10³ 倍，使 FG-NTR 相互作用更加稳定。

　　3.1.3 细胞质丝和核篮

　　细胞质丝是由胞质环向细胞质延伸形成的丝状结构，可以募集货物运输因子复合物并参与核 - 质运输，协调信使核糖核蛋白颗粒的输出和重塑，为翻译做准备。对于细胞质丝的研究主要关注了组成细胞质丝的核孔蛋白，及其在神经退行性疾病、心脏疾病和癌症等病理过程中的相关机制。

　　核篮与 NPC 支架相连接，是由核环侧延伸出的纤维丝相互汇集形成的鱼笼状结构。在物质的核 - 质穿梭过程中，被转运的物质必须通过核篮，因此这一结构在核 - 质运输过程中具有重要作用。在高等真核生物中，核篮主要由三种核孔蛋白组成：位于篮状结构底部的 Nup153、Nup50 以及包含四个卷曲螺旋结构域的 Tpr。

　　其中 Tpr 是纤维丝的主要组成部分，由跨越超过 1500 个残基的巨大卷曲螺旋区域组成，这些残基可以同源寡聚化，其次是一个高度酸性的 C 端区域，该区域大部分是无序的，而 NPC 靶向区域位于 N 端卷曲螺旋区域。Nup50 包含一个 N 端区域，一个中间的 FG 重复区域，以及一个 C 端 Ran 结合域，其中 N 端区域能够介导与 Nup153 和入核转运蛋白(Importin)-α 的相互作用。Nup153 包含一个 C 端的 FG 重复区域，以及 4 个与 Nup358 同源的 Ran 结合锌指结构域，人类 Nup153 对于 Tpr 和 Nup50 在 NPC 中的定位是必需的，这表明 Nup153 将其他核篮组分锚定到 NPC 上。

　　3.2 NPC 介导的物质核 - 质转运过程

　　构成 NPC 的多种核孔蛋白共同调节生物大分子的核 - 质转运，参与染色质的组装和基因表达的调控。一般而言，物质进出细胞核主要通过被动扩散和主动运输两种方式。分子量小于 40 kDa 的小分子可以通过被动扩散通过 NPC;随着分子量增加，被动扩散逐渐减弱，大分子需要依赖于核定位或核输出序列与特定 NTR 的结合而实现主动转运。

　　NTR 核 - 质主动转运由 Ran GTP 酶和 Ran 梯度维持。在细胞质中，Ran-GAP1 将 Ran-GTP 水解为 Ran-GDP，而在细胞核中，染色质凝聚调节因子 1 将 Ran-GDP 转换为 Ran-GTP。这一过程形成了细胞核中高浓度 Ran-GTP 和细胞质中高浓度 Ran-GDP 的浓度梯度，从而为特定方向的主动运输提供能量来源。

　　目前研究最多的是依赖 NLS 和入核转运蛋白的蛋白质入核过程。在细胞质中，入核转运蛋白 α 识别蛋白质的 NLS 进而与入核转运蛋白 β 结合形成三聚体复合物，该复合物通过入核转运蛋白 β 与 NPC 中央通道的 FG 基序相互作用通过 NPC。在细胞核中，Ran-GTP 与入核转运蛋白 β 结合形成复合物，促进入核转运蛋白 α、入核转运蛋白 β 与含 NLS 的蛋白质分子解离。

　　蛋白质分子在细胞核内释放后，入核转运蛋白 β-Ran-GTP 复合体被重新输出到细胞质;入核转运蛋白 α 则需要在其它蛋白(如 CAS 蛋白)的辅助下被输出到细胞质中，再用于下一周期的分子运输。此外，有研究工作显示部分蛋白质存在仅依赖入核转运蛋白 α 或仅依赖入核转运蛋白 β、甚至不依赖入核转运蛋白的转运机制，这些特殊方式往往与蛋白质特殊结构相关，其机理仍需要进一步深入研究。

　　3.3 NPC 与机械信号转导

　　3.3.1 NPC 的力学响应

　　Wolf 和 Mofrad 于 2009 年首次提出 NPC 结构和功能变化直接参与机械信号转导过程。作为核膜上的分子转运通道，NPC 促进响应机械信号的转录因子或转录调控相关因子的细胞核 - 质转运，如心肌素相关转录因子(myocardin-related transcription factor, MRTFs)、Yes 相关蛋白(yes-associated protein, YAP)和细胞外信号调节激酶等。

　　目前关于机械力如何促进转录相关因子入核的机制主要分为两类：一是在机械力的作用下 NPC 中央通道孔径增加，从而降低了物质转运的壁垒阻碍;二是由机械力引发的生化级联信号改变了转录因子的构象，使得转录因子与 NTR 间的亲和力增强，促进其入核输运。

　　Elosegui-Artola 等提供了关于 NPC 拉伸与细胞核机械信号转导相关的实验证据。该团队使用带有 20 μm 球形尖端的 AFM 对细胞核直接施加 1.5 nN 的恒定力，诱导 YAP 易位到细胞核内，该过程的发生独立于生化信号的调控，而核膜高张力引起的 NPC 孔径扩张是 YAP 转运效率提高的关键。

　　其它研究小组对 NPC 构象的观测也支持了这一观点。NPC 在收缩和扩张时显示出不同的构象，收缩时 NPC 中央通道的直径约在 40~50 nm，而扩张时其中央通道约为 55~70 nm。NPC 收缩和扩张构象的改变主要基于 NPC 内环的动态变化，而外环的结构几乎不变。Zimmerli 等在单细胞中观察到 NPC 在收缩和扩张状态之间的转变，并且证明 NPCs 在能量损耗或细胞外高渗环境下收缩，这两种情况都会降低核膜张力。

　　在 NPC 参与的机械信号转导过程中，除了内环的动态响应外，核篮的构象也随机械信号的传递发生变化。研究表明，钙离子浓度在静电作用驱动下可以调整核篮结构和状态，以实现远端环状结构的打开或关闭。此外，对细胞直接施加的机械力也会影响核篮构象。由于细胞核骨架蛋白 SUN1/2 与核孔蛋白 Nup153 的相互作用，机械刺激可通过 SUN1/2 传递给 Nup153，进而拉伸 Tpr 蛋白，诱导核篮结构的重组。有研究小组通过计算模拟揭示，在生理条件下，核篮的构象状态可作为分子开关，将静电作用和机械拉伸耦合。

　　3.3.2 机械响应信号分子的核 - 质定位

　　YAP 作为一种响应机械信号的转录激活因子，可在机械力的作用下实现核 - 质穿梭，但其通过 NPC 的具体机制仍存在大量未知。首先，YAP 的氨基酸序列中并没有发现典型的 NLS 序列，而 YAP 的分子直径(~65 kDa)大于 NPC 允许被动扩散尺寸的阈值，因此当细胞核膜上的 NPC 在机械力作用下扩张时，可能会引发 YAP 蛋白的被动扩散入核。

　　YAP 也可能通过非典型 NLS 序列与 NTR 结合，进而完成其核 - 质穿梭过程，然而这一假设仍需要更多的实验数据支撑。此外，YAP 作为 Hippo 信号通路的下游信号分子，可以发生磷酸化、乙酰化、甲基化等多种翻译后修饰，其自身构象的变化也会影响其通过 NPC 的动力学过程，但 YAP 不同翻译后修饰与 NPC 互作的具体模式目前仍不清楚。

　　另一个决定 YAP 细胞核 - 质定位的重要因素是其与 Angiomotin(AMOT)家族蛋白的结合。AMOT 可竞争性结合 YAP 或 F-actin，当细胞受到机械力刺激时，细胞质中的 F-actin 浓度升高，招募 AMOT 并使 YAP 从 YAP-AMOT 复合物中释放，随后 YAP 进入核内。然而 AMOT 在 YAP 向核内运输过程中的具体调控体制仍不清楚。

　　与 YAP 类似，MRTF-A 的核 - 质穿梭也受到细胞骨架的影响。MRTF-A 中的精氨酸、脯氨酸、谷氨酸和亮氨酸(RPEL)保守结构域含有 NLS，可通过与入核转运蛋白 α 和转运蛋白 β 结合通过 NPC，该结构域同时也是 G-actin 的结合位点。因此入核转运蛋白和 G-actin 竞争性结合 MRTF-A 中的 RPEL 结构域。在无机械力刺激的条件下，细胞质中的 G-actin 与 MRTF-A 结合，而当机械刺激促进细胞骨架聚合从而使 G-actin 的浓度降低时，MRTF-A 可与入核转运蛋白结合进入细胞核。

　　综上，对于机械信号引起的物质跨核膜转运过程，目前研究主要集中在 NPC 自身构象改变和机械力引发的生化信号两方面。一方面机械力调控 NPC 自身结构和功能变化，另一方面，机械信号通过磷酸化修饰等方式调控转录因子和转录调控相关因子经 NPC 的核 - 质定位，最终影响核内基因表达。结合实验数据和模型预测进一步深入探究 NPC 选择性物质转运的分子机制，有助于我们更好的理解 NPC 如何介导物质核 - 质转运以及 NPC 在机械信号转导过程中的作用。

　　4 染色质与生物力学

　　染色质作为遗传信息的分子存储装置已被广泛关注。细胞核内，染色质与细胞核骨架之间存在广泛的物理连接，上述结构不仅维持着细胞核的结构稳定性，还调控着基因表达过程。近年来研究发现，染色质不仅是机械信号通过级联生化反应调控基因转录的细胞核内执行单元，应力 / 应变还可以直接调控染色质构型在机械信号响应过程中扮演重要的角色。本章从染色质的基本结构出发，介绍量化染色质物理构象的方法，进而探讨染色质在细胞机械信号转导过程中的关键作用。

　　4.1 染色质的基本结构与物理状态

　　4.1.1 染色质的基本结构

　　在真核生物中，DNA 并非裸露存在的，而是缠绕在由核心组蛋白 H2A、H2B、H3 和 H4 组成的八聚体上形成核小体。核小体长度约为 1.9Å，由 147 个碱基对的 DNA 分子以左旋超螺旋缠绕组蛋白八聚体约 1.7 圈，核小体核心结构分子量约 225 kDa。核小体被进一步压缩、凝聚成 30 nm 的染色质纤维，再进一步折叠形成染色质高阶结构。

　　根据染色质的折叠程度与转录活性分为常染色质和异染色质。与常染色质相比，异染色质的堆积更为密集、转录活性更低且倾向于分布在细胞核周围。在结构上，LADs 将核骨架蛋白组分核纤层与染色质联系起来，细胞外机械刺激可通过 LINC 复合体传递至核纤层，进而通过 LADs 传至染色质，影响染色质空间状态和基因表达。除此之外，由于染色质是一种带负电荷的聚合物，因此可以根据周围环境的离子条件动态的改变局部结构，从而直接影响基因组在细胞核中的读取方式。

　　4.1.2 染色质的物理状态

　　不同课题组从不同尺度对染色质的构象和物理状态进行了研究，得到了染色质的不同物理状态，如液态、固态和凝胶态。染色质的物理状态由自身固有性质(核小体组成、组蛋白修饰)和环境因素共同决定。

　　Gibson 等研究发现，直径 100~200 nm 的染色质凝聚体表现为液滴状，液滴之间可迅速融合，光漂白后荧光恢复实验显示荧光标记的核小体阵列在液滴中自由扩散，提示凝聚体中核小体可能通过液 - 液相分离的过程自组装。Strickfaden 等的体外和体内研究表明，染色质进一步压缩到 μm 尺度时以固体状态存在，其特性可以抵抗外力并形成弹性凝胶，为染色质结合蛋白的液 - 液相分离过程提供支架。上述研究提示染色质凝聚物在不同尺度范围的表现形式不同，在 nm 范围内表现出液体特征，而在 μm 尺度上显示出固体特征。

　　近年来，直接对染色质施加力并测量其物理性质的技术不断发展，丰富了我们对染色质力学特性的理解。通过使用磁性颗粒，研究者对活细胞中染色质的纳米力学性质进行了直接观察，结果表明细胞周期间期的染色质为凝胶态。最近，Keizer 等构建了一种在活细胞核内用可控磁力主动操纵基因组位点的方法。该方法通过带有四环素阻遏蛋白(TetR)的磁性纳米颗粒与基因组四环素抗性操纵子结合，检测到在接近 pN 力的作用下染色质出现的超过 μm 范围的黏弹性位移，首次评估了活细胞内染色质对外力的响应情况。

　　通过这项技术发现染色质并非凝胶态，而是以液态形式存在。这一技术为未来从染色体力学到基因组功能领域的研究开辟了途径，然而该工作是基于已知的基因组阵列实现的，对于基因组不同操作位点(异染色质或常染色质)的选择可能会影响染色质状态。因此，未来在不影响细胞核内基因组环境的基础上，在不同细胞类型中评估染色质物理状态非常重要。

　　4.2 染色质对力学刺激的响应

　　研究表明，细胞外的力学刺激可在几毫秒内从细胞黏附位点传递到细胞核导致染色质 “拉伸”，并且力学刺激可激活细胞膜上 Piezo 1/2 等机械敏感离子通道触发下游生化信号转导。因此，染色质的力学响应是机械信号转导调控基因转录的一个重要层面，其中，受到广泛关注的是细胞外力学刺激通过 “细胞局部黏着斑 - 细胞骨架 - LINC 复合体” 直接将力学刺激传递至细胞核，进而引起染色质拉伸、调控基因转录。

　　汪宁教授团队的研究提供了染色质对力学刺激响应的直接证据。例如，该团队应用三维细胞磁力扭转系统，通过精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸包被的磁珠，对细胞表面施加局部应力。为实现活细胞中染色质拉伸的可视化，团队使用了一种含有细菌人工染色体和稳定表达 EGFP-Lac 阻遏物(GFP-LacI)的中国仓鼠卵巢 DG44 细胞系，应用 GFP-LacI 与 LacO 的高亲和力标记二氢叶酸还原酶基因(dihydrofolate reductase, DHFR)，研究发现应力经由整合素、细胞骨架和 LINC 复合体传递至核纤层，随后在 BAF 和 HP1 蛋白的作用下造成染色质的拉伸，并促进了 RNA 聚合酶 II 和转录因子的结合，最终上调了 DHFR 的基因表达。

　　在该团队的另一项工作中，同样使用三维细胞磁力扭曲系统对活细胞施加了大小为 15 Pa、加载频率为 0.3 Hz 的应力。通过对 GFP 标记的 DHFR 基因所在的染色质结构域的形变程度量化以及有限元拟理论模型分析发现，细胞对大小相同但模式不同的应力(沿细胞长轴、短轴、长轴和短轴的平分线的应力)响应有所差异。应力沿细胞长轴施加而引起的染色质拉伸程度最低(5%)，而沿短轴施加而引起的染色质拉伸程度最高(25%)，沿平分线施加而引起的染色质拉伸程度中等(10%)。同时，DHFR 的基因表达水平与染色质拉伸程度呈正相关关系。上述研究工作提示，作用在细胞膜的力学刺激直接拉伸染色质、调控基因转录。

　　目前，染色质对力学刺激响应的大多数研究工作中，染色质的力学加载依赖于细胞骨架和 LINC 复合体的呈递。由于缺乏在活细胞对染色质直接施加和测量力工具，限制了对染色质直接力学响应的深入研究，而前文 4.1.2 中提及的在活细胞核内用可控磁力主动操纵基因组位点的方法，实现了对细胞核内特定染色体和基因的力学测量，未来可能可以作为量化染色质力学响应的工具，进一步拓宽对染色质生物力学响应过程和机理的理解。

　　4.2.1 染色质对基底刚度的响应

　　众所周知，基底刚度可以通过控制干细胞的基因表达模式调节细胞命运。间充质干细胞通过增加核膜张力响应细胞外基质刚度增加过程，通过抑制组蛋白去乙酰化酶上调组蛋白乙酰化，实现成骨细胞的命运决定。而另一项研究提示，基底刚度的升高导致组蛋白去乙酰化酶活性升高并诱导染色质的浓缩，使成纤维细胞转化为肌成纤维细胞。这提示我们，在不同类型的细胞中基底刚度对染色质的调控方式有所不同。

　　在细胞感知基底刚度的过程中，人们普遍认为肌球蛋白 II(Myosin II)和 F-actin 在其中起重要作用。刚性基底可激活肌球蛋白 II，从而在细胞质中产生更大的细胞骨架应力，通过 LINC 复合体传递至细胞核，进而对染色质结构产生影响。Rabineau 等研究了上皮细胞的染色质在不同刚度基底上行为和状态，染色质在 100~200 kPa 的基底上主要以常染色质的形式存在，当基底杨氏模量降至 50 kPa 时，部分常染色质向异染色质转变。当细胞在软基底(<10 kPa)上时常发生细胞溶解现象，导致染色质从细胞核中释放，细胞死亡。进一步通过添加药物抑制组蛋白去乙酰化酶，可以保持乙酰化组蛋白，从而维持常染色质的形式和保持完整的核膜及核周细胞骨架网络。

　　基底刚度是影响细胞表型可塑性和染色质稳定性的关键环境因素，在调节表型变化方面发挥了重要作用，而且机械刺激被移除后这些表型变化仍持续存在一段时间，这种现象被称之为机械记忆(mechanomemory)。染色质中组蛋白乙酰化程度参与机械记忆过程，在基底软化后根据细胞在刚性基底上生长的持续时间表现出可逆或不可逆性。

　　不仅如此，当基底由硬向软转换时，干细胞通过转录因子产生对刚性基底的机械记忆。例如，在软的聚乙二醇水凝胶上培养的间充质干细胞中，YAP/TAZ 和 RUNX2 的活性取决于之前在聚苯乙烯培养皿上的培养时间。此外，非编码 RNA 也参与干细胞机械记忆机制。例如 miRNA21 在硬基底培养的间充质干细胞中积累，抑制 MRTF-A 表达，在转移到软基底 14 天后，miRNA21 依旧保持较高水平。当干细胞分化或成熟细胞被重编程为未分化细胞时，染色质结构和细胞核结构的长期变化也可能参与机械记忆。

　　最近的研究关注了组蛋白修饰诱导染色质重塑过程中的细胞机械记忆机制。Scott 等的工作表明，当软骨细胞培养在高刚度基底上时，H3K9me3 定位于软骨细胞的核膜附近，当软骨细胞转移到柔软的 3D 培养环境时，核膜附近 H3K9me3 标记的染色质重塑会被保留，去甲基化酶 KDM4 可以部分破坏 H3K9me3 对于高刚度基底的机械记忆。

　　除基底刚度的刺激外，其它的力学加载方式也会引起染色质的机械记忆。例如，Rashid 等应用三维细胞磁力扭曲系统对活细胞局部分别施加大小为 15 Pa、持续时间为 2 min 或 10 min 的应力，撤销外力后的几十分钟时间内，GFP 标记的染色质能够保持被拉伸的状态，并且这一机械记忆现象的维持时间与应力施加的持续时间成正比。深入的机制研究表明，通过整合素施加的局部应力可使染色质去致密化，并增加细胞核内染色质相关蛋白的迁移速率。有趣的是，使用 NPC 激活剂 Pitstop 2 可以消除这一机械记忆现象，而 NPC 抑制剂小麦胚芽凝集素阻断 NPC 的运输延长了机械记忆的持续时间，提示染色质的机械记忆与 NPC 的通透性有关。

　　染色质对力学刺激的响应过程以及染色质结构的变化在疾病发生发展过程中具有重要影响。例如，由基质刚度诱导的细胞核机械信号转导驱动染色质重塑，因此，主动脉瓣狭窄患者的肌成纤维细胞的染色质比健康者的肌成纤维细胞的染色质具有更浓缩的结构。由于细胞外力学微环境是一个复杂体系，所以基底对细胞命运和行为的影响不仅涉及基底刚度，也包含基底的黏弹性、应力松弛等性质，这对体外模拟实验的材料设计与选择提出了更高的要求，以更好地在体外复现体内生理、病理过程。

　　4.2.2 染色质对基底微拓扑结构的响应

　　基底微拓扑结构或微图案通常被认为是不同于基底刚度的力学作用。基底微拓扑结构通过细胞几何形状影响染色质结构和功能，其潜在机制包括细胞骨架分布和排列的改变以及肌动蛋白依赖的应力各向异性。

　　研究人员使用具有微拓扑结构的基底改变细胞几何形状，通过全转录组测序揭示了细胞几何形状与基因表达的关系，细胞增大增加了基质合成相关基因的表达，而细胞与基底接触面积的减少使参与细胞稳态的基因上调。有趣的是，在不同拓扑结构的基底上，细胞组蛋白去乙酰化酶 3 的核 - 质分布以肌动球蛋白依赖的方式调节组蛋白乙酰化。

　　微槽基底可诱导染色体在细胞核内的重新定位。在形态学水平上，1 号染色体从细胞核的中心位置向核周区域移动，表明 1 号染色体从常染色质状态向异染色质方向变化。在基因表达水平上，在微槽基底上培养的细胞中，1 号染色体有最多的基因差异表达和最多的转录本下调。相反，18 号染色体的基因表达变化最少，19 号染色体上调的基因最多。

　　同样使用微槽基底，Downing 等的研究表明，通过微槽基底可降低组蛋白去乙酰化酶活性和上调组蛋白 H3 甲基转移酶的亚单位 WD 重复结构域 5(WDR5)的表达，导致组蛋白 H3 乙酰化和甲基化增加，促进成纤维细胞向间质上皮的转变。另外，Morez 等使用平行的微槽基底来增强心脏祖细胞向心肌细胞的定向分化。在这项研究中，微槽基底能够引起组蛋白 H3 乙酰化的增加，允许通过 “干性” 因子进行细胞重编程，并且微槽基底促进了心肌素泛素化，进而影响该转录共激活因子的翻译后修饰过程。上述实验表明，基底微拓扑结构通过改变染色质来调节细胞的命运和功能。

　　5 机械信号转导过程中细胞核各组分的相互作用

　　细胞通过局部黏着斑与细胞外基质锚定，并将外部机械刺激通过细胞骨架 - LINC 复合体传递到细胞核。此外，在细胞外力学刺激作用下细胞骨架重新排列，通过 LINC 复合体将机械力传递到核纤层或 NPC 结构，从而影响染色质和 NPC 的结构。由此可见，在机械信号转导过程中，细胞核内各组分并非单独存在或发挥功能，而是以核纤层蛋白为核心各组分相辅相成、共同协作。在此，从核骨架与染色质、核骨架与 NPC、NPC 与染色质 3 个方面的相互作用对细胞核机械信号响应过程进行进一步解读。

　　5.1 核骨架蛋白与染色质的相互作用

　　染色质结构和核内空间分布对基因转录的激活或抑制至关重要。一般而言，结构疏松、转录活跃的常染色质多位于细胞核中心，而结构紧密、转录抑制的异染色质则位于核周核纤层附近。异染色质的核周定位与 LADs 和核纤层的互作密切相关。LADs 富含抑制性组蛋白修饰，如 H3K9me2、H3K9me3 和 H3K27me3，一般不含活性染色质标记，如 H3K4me。

　　越来越多的证据表明，核骨架蛋白调控染色质结构和核内定位以响应力学刺激，此外，核骨架和染色质之间的相互作用还可以调节细胞核的稳定性。本节介绍核骨架蛋白与染色质之间的相互作用，重点关注其对细胞核力学特性、染色质空间分布和基因转录的影响。

　　5.1.1 互作调控细胞核力学特性

　　染色质本身对细胞核刚度的贡献有别于核纤层。染色质主要调节应变小于 30% 时的核变形，而这些小变形过程中核纤层发生结构和翻译后修饰等改变，使得细胞核变硬以抵抗较大的核变形。

　　Lamins 蛋白在细胞核骨架与染色质互作过程中发挥重要作用，可以调节染色质流动性进而对细胞核的刚度产生显著影响。Schreiner 等使用光镊发现，INM 栓系因子(tethering factor)缺失使细胞核刚度变小，并且细胞核内染色质的迁移率和流动性增加。Progerin 蛋白(突变的 Lamin A 蛋白)累积导致细胞核外周异染色质和核骨架之间的连接缺陷，异染色质含量减少，细胞核刚度降低;同样，Lamin B 的缺失也会减少异染色质的数量，从而使细胞核变软。此外，核质中游离的 Lamin A 通过直接与 DNA 结合或通过 H2A/H2B 核心组蛋白与染色质交联，从而限制染色质在细胞核内的扩散和移动。

　　5.1.2 互作影响染色质空间分布

　　虽然哺乳动物 Lamin B1/B2 和 Lamin A/C 在亚微米尺度上形成不同的交织纤维网络，但是 Lamin B1/B2 和 Lamin A 的(未检测 Lamin C)DNA腺嘌呤甲基转移酶识别位点在全基因组范围内非常相似。然而，对 HeLa 细胞中微球菌核酸酶(只降解核小体连接区 DNA 的核酸酶)消化的染色质进行染色质免疫共沉淀结合测序分析(ChIP-seq)发现，Lamin A/C 和 Lamin B 具有各自特定的 LADs 区域。上述两种情况共同表明，不同 Lamins 蛋白可能与相同的 LADs 相互作用，但其作用频率不同。

　　Gesson 等通过对富含常染色质和异染色质的样品进行 ChIP-seq 测定发现，Lamin B1 主要存在于核外周与异染色质互作，而 Lamin A/C 分布于整个细胞核，也可与常染色质相互作用，并与染色质结合蛋白 LAP 2α 结合。

　　Lamins 蛋白的缺失可导致染色质重组和异染色质从细胞核骨架上脱离，Zheng 等结合高通量染色体构象捕获(high-throughput chromosome conformation capture, Hi-C)与荧光原位杂交，揭示 Lamins 蛋白缺失导致小鼠胚胎干细胞中特异性 LADs 与核骨架脱离，脱离的 LADs 破坏了 LADs 和细胞核内部染色质的相互作用。总之，上述研究提示 Lamins 蛋白在染色质组装和基因表达调控中发挥核心作用。

　　5.1.3 互作影响基因转录

　　应力诱导的基因表达变化可能是由染色质结构改变介导的，包括染色质可及性、组蛋白的拓扑结构和翻译后修饰。机械刺激调控 Lamins 与 LADs 互作引起异染色质从细胞核外围移至细胞核内部、增加 DNA 的可及性，通过调节染色质结构影响基因转录过程。例如，5 pN 的机械载荷在不到 30 s 的时间内可以诱导染色质发生解聚，从而导致被拉伸区域的转录增加。值得注意的是，持续机械负荷的效应反映了一种具有基因沉默效应的机械适应过程，这可能是一种负反馈机制。

　　数据表明，力对染色质的影响是时间、大小和细胞类型依赖性的。对培养的人类表皮干细胞施加 5%~40% 的周期性单轴拉伸 30 min，异染色质标志分子组蛋白 H3K9me3 水平下降，这种翻译后修饰与异染色质浓缩和基因转录抑制有关，而异染色质的减少有助于细胞核软化，通过核软化的形式有效耗散机械能防止 DNA 损伤。如果这种机械拉伸持续数小时，细胞会垂直于拉伸方向排列，从而将细胞核的应变降至最低，使细胞恢复稳态。有趣的是，如果拉伸是双轴的，细胞无法重新排列以降低应变，则 H3K9me3 水平降低，但另一种异染色质标记物 H3K27me3 代偿增加。

　　从细胞黏附处传递到细胞核的机械力已被证明可在施力后数秒内立即导致染色质拉伸，而当这一机械力持续施加 1 h 后，染色质拉伸与机械敏感基因表达的激活相关。

　　作用在染色质上的力学刺激如何实现只激活某些特定基因的表达，这仍是一个未解决的关键问题，而核骨架蛋白与染色质互作调控的基因在细胞核内定位可能起到重要作用。例如，表皮分化复合体基因簇在未分化的表皮干细胞中没有活性，此时基因座靠近核纤层的位置;在干细胞分化过程中，该基因座被证明更集中于细胞核内部，并激活相关基因表达。

　　通过 LINC 复合体对核纤层施加张力，对维持染色质的压实和相关基因的沉默至关重要。在小鼠中，LINC 复合体中 SUN 蛋白的缺失导致细胞核的张力降低，增加了染色质的可及性引起表皮干细胞提前终末分化。此外，核骨架蛋白参与的细胞核刚度可能在应变引起的细胞特异性异染色质变化中发挥作用。例如，人肿瘤细胞系的 Lamin A 含量较低，因此核硬度和核膜张力也较低，它们对力诱导的异染色质标记分子 H3K9me3 消耗具有耐受性。

　　核内 actin 参与的染色质结构调控也影响基因的转录活性和表达水平。核内 actin 可能通过多种途径调控基因表达：a. 核内 actin 存在于染色质重构复合物中;b. 核内 actin 与三种 RNA 聚合酶都有相互作用且影响 RNA 聚合酶的转录活性;c. 核内 actin 调控转录辅助因子 MAL 的活性;d. 核内 actin 影响长程染色质组织结构和 DNA 损伤修复。

　　此外，NPC 通过对 G-actin 的转运将细胞核和细胞质的肌动蛋白动力学联系在一起。研究发现，细胞内总 actin 约有 20% 分布于细胞核内，为维持 actin 在细胞质和细胞核之间的平衡，G-actin 不断通过 NPC 穿梭于核 - 质之间，其中 Importin 9 和 Exportin 6 蛋白介导的细胞核主动转运过程发挥了关键作用。胞质中的 F-actin 聚合可降低核内 G-actin 水平，进而导致 RNA 聚合酶 II 转录延长的减少，随后 H3K27me3 在启动子处积累导致基因沉默。

　　总之，细胞核内结构在基因调控中扮演着关键角色，通过影响细胞核的形态以及染色质的结构，参与应力 / 应变调控的细胞核功能和基因表达。然而，机械信号转导过程中核内成分互作调控基因转录的具体机制和调控网络仍不清楚，需要更深入的研究。

　　5.2 核骨架蛋白与 NPC 的相互作用

　　细胞在高基质刚度的环境中，通过黏着斑 - 细胞骨架 - LINC 复合体的传递导致细胞核扁平化，从而拉伸 NPC，降低其对分子运输的机械阻力，并增加小分子蛋白的被动核转运和 YAP 的核输入。然而，对于 NPC 的 3D 建模显示，扩张或收缩构型的 NPC 均为圆形且显示出相似的中央通道面积，似乎排除了中央通道在分子核 - 质转运调节中的主要作用，并将 NPC 输运能力的变化归因于核篮的重排。基于这些证据，有研究提出基于 NPC 机械激活的新模型：细胞外机械刺激通过 SUN1 传递给核篮蛋白 Nup153，Nup153 拉伸另一核篮蛋白 Tpr，诱导核篮结构重组，而核篮结构的开启或关闭引起物质进出细胞核更高或更低的通量。

　　细胞外机械应力调控的核篮构型变化受到 LINC 复合体的影响，其中 SUN1 和 Nup153 之间的相互作用在细胞的生理病理行为中起作用。Pull-down 实验表明，SUN1 蛋白的 N 端和 C 端都参与了与 Nup153 相互作用，这一结果得到了免疫荧光的支持，GFP 标记的 SUN1 与 Nup153 显示出共定位。进一步的研究发现，RNA 干扰 SUN1 或过表达 SUN1 突变体的细胞表现出 NPC 的聚集，这意味着 SUN1 是维持 NPC 在细胞核表面均匀分布的重要因素，而在 Nup153 缺失的细胞中，SUN1 的位置也发生了改变，进一步验证了 SUN1 和 Nup153 的相互作用关系。

　　NPC 也可与核骨架蛋白中的核纤层蛋白质网络结构相互作用。Nup153 的 N 端和 C 端都存在核纤层蛋白结合结构域，这些结构域具有与 Lamin A 和 Lamin B 的 Ig 折叠结构域结合的潜力。在人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞中敲除 Nup153 使细胞核形态出现内陷，且 Lamin A/C 的荧光图像呈点状分布。进一步研究发现，Nup153 的敲除导致了细胞的极化缺陷且显著降低了细胞的定向迁移速度。

　　NPC 还可以通过胞质丝 Nup358 介导有丝分裂中期微管 - 着丝粒的附着过程，在细胞间期 Nup358 通过其 N 末端区域与细胞骨架蛋白微管相互作用。过表达 Nup358 的细胞显示出显著的微管结构改变，包括微管的聚集和稳定性增加。NPC 与核内 actin 之间存在相互作用。核内 actin 可以调节 NPC 的通透性，影响细胞核内大分子物质的转运和交换;同时，NPC 通过对 G-actin 的细胞核 - 质转运调控核内 actin 含量。除此之外，NPC 还具有染色质结合区，通过与染色质结合发挥重要的染色质空间定位和基因转录调控作用。

　　5.3 NPC 与染色质的相互作用

　　除传统的核 - 质转运功能外，NPC 还通过与染色质的物理相互作用参与基因组调控，在癌症和神经退行性病变等多种疾病过程中起重要作用。早期的细胞学观察显示，核内浓缩的异染色质主要分布于 INM 下层，但分布并不连续而是被部分疏松的染色质所中断，而这些中断位置与 NPCs 密切相关。酵母、果蝇、人类等多种生物中的全基因组测序揭示了核孔蛋白在基因调控中的作用。本节讨论 NPC 与染色质中启动子、增强子和其它结构的互作方式。

　　5.3.1 NPC 与启动子互作

　　果蝇和哺乳动物细胞中的研究表明，核孔蛋白 Nup98 和 Nup153 与转录活跃的染色质区域相互作用，靶向一些活跃的启动子，调控基因表达。例如，Nup98 与甲基相关结合域 2、Trithorax 反应元件和 WD40 结构域蛋白共同占据基因 Hph 和 CG10851 的启动子区域，促进基因表达。游离的核孔蛋白还可以在整个细胞核空间中与染色质结合，并且这类互作主要发生在具有转录活性的开放染色质区域。

　　有趣的是，删除 GAL2 的开放阅读框并不影响活性 GAL2 与 NPC 的关联。GAL1 基因与 NPC 的物理相互作用集中在启动子上，这一相互作用需要 Gal4 激活，但不需要 SAGA 组蛋白乙酰化酶复合物，也不受 RNA 聚合酶 II 失活的影响。上述研究提示，NPC 与染色质的启动子互作是由 DNA 元件引导的，不依赖活性转录。

　　5.3.2 NPC 与增强子互作

　　除了启动子外，多个研究小组发现核孔蛋白还可以与增强子相互作用，尤其是 H3K27 乙酰化水平增高和多转录因子结合的超级增强子。例如 Nup153、Nup133 和 Elys 等多个核孔蛋白，在结肠癌细胞的连接增强子和致癌超级增强子中富集以促进基因转录。

　　基于 dCas9 的蛋白质组学方法也鉴定了核孔蛋白对增强子的靶向性，该方法通过 CRISPR/Cas9 系统分离 CRE 调节蛋白和远程 DNA 的相互作用，结合 dCas9 捕获和染色质相互作用分析表征了红系细胞中与特定成簇增强子结合的蛋白质，除了已知的增强子功能调节因子外，还检测到了高丰度的 Nup98、Nup153 和 Nup214。

　　在细胞分化过程中，核孔蛋白与增强子的相互作用也被证实是细胞命运调控的重要环节。对于神经祖细胞的全基因组分析表明，Nup153 和 Sox2 结合并共同调控数百个基因。Nup153 与基因启动子或转录末端位点的结合分别与基因表达的增加或减少相关，而抑制 Nup153 表达可以改变染色质的开放构型，破坏 Sox2 的基因组定位，体外和体内均可调控胶质细胞命运。

　　5.3.3 NPC 与其它染色质结构互作

　　对于 NPC 相关的染色质结构和功能研究主要关注特定核孔蛋白对特定基因转录的调控作用。在酵母中进行的一项早期全基因组研究中，Nup2、Nup60 和 Nup145 等特定核孔蛋白表现出与 GAL1、GAL2、HXK1、INO1 等具有高转录活性基因的相关性，基因被激活后优先定位于核外周区域。

　　通过乳糖操纵子系统检测核孔蛋白 Sec13 和 Nup62 与紧密折叠异染色质区域的靶向互作，发现核孔蛋白 Sec13 和 Nup62 导致凝结染色质解压缩，这一实验为核孔蛋白诱导染色质开放提供了重要证据。从机理上讲，核孔蛋白诱导的染色质开放依赖核孔蛋白 Elys，并且需要依赖 ATP 的染色质重塑 BRM 复合物。线虫中进行的研究确定了 Elys 的同源物 MEL-28 与 SWI/SNF 染色质重塑复合体之间的相互作用。少突胶质细胞中 Sec13 结构同源物 Seh1 也被发现与 Brd7 等染色质重塑因子的互作关系。Seh1 的缺失会诱导染色质的压实，导致染色质可及性降低。另有研究发现，Nup98 与修饰 H3K4 的组蛋白甲基转移酶之间存在相互作用。

　　核孔蛋白与染色质相互作用在转录记忆的分子机制中具有重要作用。通过转录记忆过程，之前激活的基因在经过一段时间的抑制后，在后续激活时会做出更强的反应。Nup98 同源物是不同物种特定基因的转录记忆和动态再激活所必需的，包括酵母中肌醇诱导的 INO1 基因和人体细胞中干扰素 -γ 诱导的基因。被干扰素 γ 诱导的基因再次受到干扰素 γ 诱导时表现出更强烈的反应，这种 “记忆” 效果可在细胞分裂 4~7 次后仍持续存在，且这一过程与 H3K4me2 和 RNA 聚合酶 II 的稳定结合相关，并需要与核孔蛋白 Nup98 的物理相互作用。

　　6 细胞核生物力学研究技术的进展

　　多种工具和平台已被开发用于细胞核生物力学研究，如 AFM、微流控平台、图像处理算法辅助的细胞力测量技术、微 / 纳米尺度操作的技术等。新技术和新方法的不断突破为应力 / 应变的精准加载、细胞核力学特性的表征以及细胞核机械信号转导过程的定量化描述提供了重要支撑，为全面理解细胞核生物力学机制提供了重要的平台。

　　6.1 细胞核生物力学的主要检测技术

　　6.1.1 AFM

　　1986 年，Binning 等为在原子分辨率下对非导体材料表面进行成像，在扫描隧道显微镜的基础上发明了 AFM。AFM 的工作原理是基于激光测量悬臂偏转实现对探针和样品表面之间的作用力检测，其基本装置包括带探针的微悬臂、悬臂偏转传感器、压电定位器以及传感器和定位器之间的电反馈机制。在力谱模式下，探针以可控的方式趋近样品并退回，悬臂偏转和悬臂位移被转换成力与距离或时间曲线。

　　由于 AFM 对材料成像、探测和操作的灵活性，使其成为纳米科学中常用的仪器。最初的 AFM 是在真空中运行的，Marti 等实现了 AFM 在液体环境和环境温度下工作，推动了 AFM 向生物学的发展，并促进了生物分子和细胞在纳米分辨率下的检测和分析。

　　使用化学修饰的 AFM 探针对生物分子之间黏附力进行的测量，为生物系统的生化特性描述开创了重要技术平台。AFM 探针可以探测非特异性或特异性的生物分子相互作用，包括生物大分子或受体和配体之间的相互作用。在单分子水平上，这种相互作用可以理解为多个协同作用的非共价相互作用的总和(如氢键、范德华力)，并可以确定其稳定性和寿命。

　　基于 AFM 的单分子力光谱技术是目前测量分子内和分子间力的理想方法，具有高空间分辨率和力灵敏度(1 pN 到 100 nN)，其优势在于可以与高分辨显微技术、拉曼光谱技术等先进技术结合，直接观察和记录单个分子的行为。例如，通过单分子力光谱技术追踪单分子解离事件可以提供有关生物大分子(如蛋白质和核酸)之间相互作用的信息，从而增加我们对生物过程的认识。

　　AFM 对细胞核力学特性的表征由悬臂压陷细胞实现。例如有研究使用带有 6 μm 微球的悬臂对贴壁乳腺癌细胞的细胞核和细胞骨架进行了刚度测量，在 5 nN 条件下，人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 细胞核的刚度为 157.7±78.55 Pa，明显高于细胞骨架刚度(103.42±89.45 Pa)。Krause 等将 AFM 和共聚焦显微镜进行组合，在测量细胞核刚度的同时可视化了悬臂与核接触的过程，并且对比了针形探针和球形探针的测量效果。与针形探针相比，球形探针的测量结果可重复性更强，该研究进一步使用 10 μm 球形探针在 0~1.5 nN 的条件下测得人纤维肉瘤细胞 HT1080 细胞核刚度在 270 Pa~2.29 kPa 范围内。

　　然而，上述基于 AFM 的方法都是在细胞整体水平上对细胞核进行的测量，无法排除细胞膜或细胞骨架的影响。为解决此问题，Liu H 等使用聚焦离子束对 AFM 进行了改良，在不同基底上使用尖锐的针形探针穿透瓣膜间质细胞胞膜对细胞核力学特性进行原位表征，根据 AFM 压痕曲线上的两个不同节段确定细胞质和细胞核的刚度，并与共聚焦显微镜图像同时重建进行相关性分析。其结果表明，软基底(11 kPa)上的细胞核刚度(26.54±3.41 kPa)低于硬基底(聚苯乙烯)上的细胞核刚度(84.36±16.16 kPa)，并且体外分离的细胞核刚度(9.29±1.80 kPa)明显低于前文所述的细胞内原位细胞核刚度。

　　AFM 技术也用于探测染色质构象，可以实现对核小体尺寸和动力学的测量。Yamini Dalal 团队在体外液体环境中重建了组蛋白 H3 的变体−着丝粒蛋白 A(Centromere protein A, CENP-A)核小体和 H3 核小体，AFM 结果显示测量，CENP-A 核小体与 H3 核小体具有相似的尺寸，分别为 3.8±0.3 nm 和 3.7±0.3 nm。该团队进而测量了核小体在 67.5 mM Na⁺，2 mM Mg²⁺条件下的弹性模量，该条件接近生理渗透压和离子浓度。结果显示单个 CENP-A 核小体的弹性模量为 18.5±15.6 MPa，是 H3 核小体(35.4±13.9 MPa)的一半;同时 CENP-A 和 H3 单核小体具有均匀的弹性模量分布，为均质圆柱体。此外，高速 AFM 用于可视化 CENP-A 核小体的自发动力学，观察 CENP-A 核小体自发且可逆的构象改变。通过将 AFM 和光镊结合，已发现 HMGB 蛋白能破坏 DNA 的稳定性并将其从 H2A-H2B 二聚体上解离，从而调节染色质的可及性。

　　总之，AFM 是测量细胞力学特性和细胞核力学特性的经典方法。AFM 的使用通常结合赫兹接触理论、指数方程等一些数学理论等来综合描述全细胞力学特性。随着基于 AFM 方法的进一步发展，特别是在通量提高和多参数测量方面的发展，将有助于实现在微纳尺度原位研究生物结构、力学特性及生理功能三者之间的关联。

　　6.1.2 微流控技术

　　微流控技术是一种通过微孔道精确控制微尺度流体的技术，可在样本量很少的情况下进行高灵敏度的检测和分析。微流控技术最初应用于化学分析领域，起源于气相色谱、高压液相色谱和毛细管电泳的小型化和集成化。科学家们在此基础上开发新的、更密集的、更通用的微尺度分析方法并寻求此类方法在生物和化学领域的应用。之后，PDMS 软光刻技术、在软光刻工艺的基础上开发的气动阀门以及基因组学快速发展，为微流控技术的发展提供了更精密的硬件支持和更广阔的应用范围。微流控技术已开始应用于蛋白质结晶条件筛选、药物开发中的高通量筛选、细胞操作等领域，本节主要关注微流控技术在细胞核力学特性检测方面的应用。

　　如前文所述，AFM 受限于研究通量低，无法在大样本中快速检测细胞核的力学特性。微流控技术的发展使研究人员能够集成和开发用于细胞和细胞核力学测量的新型高通量系统，包括微阵列技术、微通道谐振器和细胞形变测量法。微流控技术为研究结构和机械约束条件下的细胞核力学响应提供了独特平台。

　　Anselme 等检验了表面拓扑和三维结构对细胞核的影响。不同类型的细胞在平整基底上培养时，其细胞核分布没有明显差异，而在微柱上培养的肿瘤细胞表现出特殊的可塑性，细胞核向下变形为 μm 级凹槽，并形成不同的凹面和突起。Nagayama 等基于聚二甲基硅氧烷微柱阵列的研究表明，正常的血管平滑肌细胞 Lamin A/C 的表达量升高，增加了细胞核硬度，增强了细胞核对细胞外微柱的机械抵抗能力也抑制了细胞的增殖。而 Hela 细胞的细胞核变形能力较强，微柱对 Hela 细胞的增殖抑制作用不明显。该结果提示细胞变形能力与细胞核刚度相关，并且在不同的细胞类型中存在差异，因此核参数有可能作为疾病状态评估的生物标志物或预测指标。此外，微流控装置可以模拟生理环境中细胞外基质的孔径尺寸以探测细胞通过组织和间隙的能力，通过与成像设备的结合对细胞迁移过程中细胞核形变程度进行定量测量。

　　微流控技术具有样本量要求小、灵活性强、通量高、时空控制精确等突出优势，已成为细胞核生物力学研究的重要工具。总体而言，它主要从三个方面支持细胞核生物力学的研究：(1)为培养的细胞提供明确的几何约束、空间限制或纳米形貌;(2)通过流动腔对培养细胞施加流体剪切力、液压、拉伸力或膜张力;(3)通过设计特定的功能模块形成集成平台，在实现活细胞培养和机械加载的同时对其进行分子检测和信号读取。

　　微流控技术可以与抗光学漂白的半导体量子点相结合，开发基于量子点的活体荧光成像平台，用于快速追踪疾病标志物和分析复杂生物过程。另外，基于蛋白质检测的微流控芯片显示了其在基于体液的疾病诊断中的潜力。

　　6.1.3 微吸管

　　1954 年，Mitchison 和 Swann 开发出微吸管技术研究海胆卵膜的力学特性。该方法通过施加负压将细胞的部分区域吸进微管，测量吸入微管的细胞形状，并使用适当的数学模型来确定细胞的力学性能。通过对负压的控制，细胞变形及其几何参数变化可被具体量化以确定弹性或黏弹性特性。其中，表征不同细胞组分的力学性能需要不同大小的压力，小尺度的延伸可提供细胞表面的力学参数，大尺度的延伸可对细胞骨架和细胞质成分进行测量，例如测量细胞膜和细胞骨架时分别需要 1 Pa 和 1 kPa 的阈值压力。

　　采用微吸管技术，Rand 和 Burton 将红细胞膨胀成球形，测量膜的弹性模量，Waugh 和 Evans 在红细胞的自然状态下测量红细胞膜的剪切弹性模量。在微吸管研究活细胞力学行为时，Hochmuth 结合基本连续体模型对测量结果进行了解释，从而得到细胞的弹性和黏性等参数。其中，中性粒细胞表现为液体性质，其表面张力约为 30 pN/μm，黏度约为 100 Pa・s，而软骨细胞和内皮细胞表现为固体性质，弹性模量约为 500 pN/μm²(0.5 kPa)。

　　微吸管也可应用于细胞核力学特性的测量，研究分离细胞核的流变性质、特定核膜蛋白对细胞核力学性质的影响、干细胞分化不同阶段的细胞核变形等。Rowat 等通过荧光标记了染色质和核仁成分，并通过微吸管抽吸核膜以研究细胞核的物理性质。在抽吸过程中细胞核体积减少了 60%~70%，并且 Emerin 蛋白缺失的细胞核中面积扩张与剪切模量的比值显著降低。

　　Pajerowski 等使用微吸管研究了人胚胎干细胞分化过程中的细胞核力学特征变化，将细胞核形变与细胞膜形变的比值(Lnuc/Lcell)作为衡量标准，结果发现细胞核在分化过程中高度变形，Lnuc/Lcell 比值由 > 0.8 降至 0.15，硬化 6 倍左右。未分化干细胞和 Lamin A/C 敲低细胞的细胞核也表现出更多的流动性，而在持续的应力作用下，细胞核表现出更像固体的弱幂律流变学。

　　微吸管技术为细胞或细胞核的流变学特性测量提供了重要方法，该技术的吸力范围从 10 pN 到 100 nN，其测量范围是其他技术无法比拟的。微吸管技术可以测量非常软的物质的弹性和黏性，以及不同细胞器和整个细胞的机械性能，其准确性与 AFM 相当。未来，微吸管技术可能与微流控技术集成，实现相对高通量的测量，并降低仪器和测量程序的复杂性。

　　6.1.4 布里渊光谱法

　　布里渊于 1922 年首次报道了声诱导的非弹性光散射，而自发布里渊散射是光在晶体中遇到声学声子时的非弹性散射，可以确定声子的能量，从而确定与散射材料的黏弹性密切相关的原子间势。布里渊光谱法是一种基于自发布里渊散射的研究手段。与超声等检测不同，布里渊光谱不需要施加外力，可以非接触地直接读取材料的黏弹性特性，被广泛用于材料表征、结构监测和环境感知。

　　2008 年，Giuliano Scarcelli 和 Seok Hyun Yun 展示了一种基于完全平行光谱仪的共聚焦布里渊显微镜，比以往方法的检测效率提高了近 100 倍，促进了布里渊显微镜在生物医学和生物材料科学中的多种应用。利用 3D 布里渊光谱显微镜在亚 μm 分辨率下研究细胞内的异常相变，已揭示了神经退行性疾病肌萎缩侧索硬化的致病机制。作为互补的技术，基于接触的 AFM 和非接触的布里渊显微镜被用于确定反刍动物视网膜的机械特性。此外，还建立了光学相干断层扫描引导的布里渊显微镜，用于绘制小鼠胚胎组织颅内神经管闭合过程中的原位生物力学图谱。因此，布里渊光谱显微镜可以满足从亚细胞水平到组织水平的多尺度生物组织力学表征。

　　布里渊显微成像光谱仪(如 VIPA)的光谱分辨率约为 500 MHz，利用受激布里渊效应，可将之前的光谱分辨率提升至 100 MHz，但这种方式使用的连续激光照明没有充分利用受激过程的非线性效应，而且所需的高照明功率为 265 mW，限制了在长时间内用于敏感样品的实时成像，这可能阻碍了其在生命科学中的更广泛应用。最近多个合作团队提出利用脉冲的泵浦探测方案将受激布里渊显微技术所需照明光功率降低 10 倍。脉冲照明方案降低了受激布里渊显微镜的光毒性，并可对线虫胚胎、斑马鱼幼体和类器官等生物样品的力学特性进行成像。在细胞核生物力学研究方面，已有研究将布里渊光谱技术与微流控技术相结合，利用光散射作为测量核力学特性的参数，提供了一种非接触和高灵敏度的检测细胞核刚度的方法。

　　6.1.5 光镊、磁镊技术

　　Ashkin 通过理论计算推测聚焦的激光能推动 μm 级的粒子，并成功使用激光束将悬浮在水中的 μm 级乳胶球沿着光轴方向推动。Ashkin 等首次证明了单光束光镊，即只需要一束高度聚焦的激光，就可以形成稳定的能量阱能将微粒稳定捕获。在随后的研究中，光镊被证明可用于捕获和操纵细菌及红细胞，以及细胞内的细胞器。光镊也产生位移的变化，伴随产生的力和力矩对感兴趣的生物大分子进行检测，如 DNA、肌动蛋白、微管和分子马达。

　　磁镊的工作原理与光镊类似，也是基于外力操纵微粒而来，两者的不同在于磁镊是通过磁力作用于磁珠实现力的施加，并且磁镊可以避免光镊引起的光损伤。Crick 和 Hughes 通过磁力拖动、扭转和刺激细胞内的磁性粒子，首次展示了磁镊的作用。此后 Smith 等使用磁镊对单个 DNA 分子进行了单分子操作，他们将 DNA 分子的一端键合到玻璃表面，另一端连接到磁珠上，通过磁场调节磁珠的位置，在磁力已知的条件下获得了力与单个 DNA 分子伸长的曲线。之后该技术被广泛使用，并被称为单分子磁镊。

　　在磁镊使用过程中，通常选择 μm 级别的超顺磁珠，并将 DNA、RNA 或核小体纤维连接在磁珠上，通过外部磁铁的定位和旋转拉伸和卷曲分子。磁镊的使用大大拓宽了科学家对 DNA 力学特性的认识，也加深了我们对聚合酶、解旋酶、拓扑异构酶等活性分子的理解。此外，由于在细胞转录、复制和重组的多个过程中存在扭矩，并且细胞有复杂的机制来调节 DNA 的超螺旋，因此磁镊在解决上述生物过程相关的问题中是一个有力的工具。

　　在使用光镊和磁镊技术对细胞表面施加力学刺激时，通常需要对微粒进行精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸序列的修饰，使其与细胞整合素等细胞黏附受体结合，进而通过光或磁力调控微粒，对细胞表面施加应力。此外，光镊和磁镊技术在表征细胞核力学特性中也有广泛应用。通过光或磁力捕获和操纵微球等装置对细胞核或核内分子在 nm 级精度和 pN 分辨率下精确地施加拉伸或扰动。

　　Meijering 等使用光镊以 0.2 μm/s 的速度拉伸染色体，同时记录了力 - 伸展曲线。在 10~50 pN 的作用力下，单个染色体表现出近似线性的伸展，而在强作用力下染色体表现出明显的非线性硬化。相比于 AFM，光镊或磁镊可以直接对细胞核进行探测，而不会激活细胞膜介导的机械转导。例如，有研究小组将 1 μm 乳胶珠注射到受精卵中，并通过光镊实现了对细胞核流变性的测量。

　　磁镊可被用来探测重组染色质纤维的结构，通过对力延伸数据拟合统计力学模型，可以推断出不同染色质纤维的高阶结构。另外，有研究使用磁镊追踪有无 NFIB 的单核小体的结构转变，以研究 NFIB 如何影响核小体动力学。在实验中，单核小体被重组到含有单一 Widom 601 序列的 409 bp DNA 片段上，分别将 DNA 的两端与盖玻片和顺磁珠特异性连接，之后持续施加张力直至 30 pN，并记录单个核小体的实时轨迹。在 NFIB 存在的情况下，核小体在大约 5 pN 的力下被完全分解，并在磁镊的重复拉伸测量中保持展开状态，而在没有 NFIB 的情况下，核小体显示出不可逆的两步展开动力学，这与之前的报道一致。

　　一项同时运用光镊和磁镊的研究从拓扑学的角度探究了 DNA 复制过程，发现染色质纤维如何缠绕决定着染色质独特的机械性能。这类精细化的机械力加载平台对于细胞核及染色质的机械信号转导的研究具有巨大潜力。

　　光镊和磁镊可以在不直接接触细胞的情况下测量细胞的力学性能，并能够与微流控等技术结合，实现对单个细胞的高精度和相对高通量的操作和测量。因此，它们在发展单细胞培养、操作的自动化平台方面显示出巨大的潜力。然而，加载在光镊和磁镊上的力学范围过小，限制了其进一步应用，仍需要进一步改良。此外，改良的技术可用于测量软材料在非线性状态下的局部黏弹性响应，并用于研究活细胞的力学特性。随着磁珠控制技术的进步，该技术可以更全面地实现细胞力学表征，如同时测量细胞表面和细胞内部的力学特性。

　　综上所述，AFM、微流控技术、微吸管、布里渊光谱和光镊、磁镊等技术在包括细胞核在内的细胞组分力学性能测定中具有重要的应用。不仅如此，上述方法还是细胞生物力学研究中重要的力学加载手段，可用于对细胞整体或不同亚细胞结构施加精准、可控的机械刺激，在整个生物力学研究领域内具有广泛用途。例如，AFM 通过在纳米尺度上探测物体表面的力和位移，并且可以以非侵入的方式精准施加应力，在细胞表面和细胞整体尺度上测量细胞的形变和力学特性;同样，AFM 也可以在聚焦离子束的辅助下穿透细胞膜，直接对细胞内部组分(如细胞核)的力学特性进行测量。另外，光 / 磁镊等技术应用光学力 / 磁场对细胞整体施加应力，并根据力与位移关系对细胞的力学性质进行量化;而通过显微注射的方式将纳米微粒注入细胞，在光 / 磁力的控制下可以精确地操控和拉伸微小的细胞内结构，对细胞内部组分进行力学性能研究。这些力学加载技术平台提供了多种手段来施加精确、可控的力学刺激，为深入理解细胞的力学行为和相关生物学过程提供了有力支持。

　　6.2 基于显微成像的检测技术

　　显微镜是细胞生物学相关研究不可或缺的工具，可以在单细胞水平实现不同时空分辨率的形态和结构检测。在细胞核生物力学相关研究中，不同分辨率的显微镜常用来显示染色质的结构和核内分布。

　　6.2.1 显微成像技术概述

　　早期普通光学显微镜被用于哺乳动物的细胞核成像，在醋酸洋红等碱性染料的结合下显示出不同细胞周期的染色体形态。然而，由于阿贝极限(水平极限约为 200~300 nm，垂直极限约 600 nm)的存在，光学显微镜的分辨率约为 250 nm，因此在显示精细结构时受到限制，而先进显微成像技术的发展为进一步解析染色质的高阶结构提供了可能。

　　电子显微镜是基于电子光学的原理，以电子束替代光束作为照明源，通过电子对样品进行透射或反射来产生样品表面的图像。Robinson 等通过电子显微镜显示了由组蛋白 H1 连接的串珠状结构，以及核小体阵列缠绕形成的更浓缩的染色质纤维。另外，对于 30 nm 的染色质纤维结构的观察通常通过扫描电子显微镜、透射电子显微镜或冷冻电镜。

　　电子显微镜原位杂交(Electron microscopy in situ hybridization, EMISH)将电子显微镜技术与核酸原位杂交技术结合，可以在高分辨率下定位具体的核酸序列。例如，通过 EM-ISH 使用生物素标记的 DNA 探针结合二氨基苯丙胺染色已被用于细胞核中染色体 DNA 的成像。

　　另外，X 射线晶体学方法也可以用于 DNA 的结构解析，其基于电子对 X 射线的散射作用，获得晶体中电子密度的分布情况，再从中分析获得原子的位置信息。2002 年，Davey 等通过 X 射线晶体学在 1.9Å 的分辨率下确定了含有组蛋白和 147 bp DNA 的核小体核心颗粒的结构。

　　6.2.2 超分辨显微成像技术

　　自 20 世纪 90 年代以来，科学家们一直在寻求突破传统光学显微技术限制的方法，直到 2009 年逐步形成了成熟的超分辨荧光显微成像技术，并获得 2014 年诺贝尔化学奖。由于超分辨成像技术种类较多，本节结合细胞核和染色质方面的应用，只选取了 2 种具有代表性的技术对其成像原理进行介绍，具体为 Gustafsson 于 2005 年发明的结构光照明显微镜(structured illumination microscopy, SIM)和 Hell 于 1994 年发明的受激发射损耗显微技术(stimulated emission depletion, STED)。

　　SIM 通过使用结构化光模式照亮样品从而超越衍射极限，在莫尔效应的影响下，SIM 将传统荧光显微镜丢失的高频信息移入到可被检测的低频区域，而后通过后续的算法优化和处理将其中的高频信息进行恢复，重建图像中准确的细节从而提高成像的分辨率。

刘中乾;齐颖新,上海交通大学生命科学技术学院力学生物学研究所,202402