桑树ISSR-PCR反应体系建立及优化

来源：江苏农业科学杂志2020年第第10期北京时间：

作者：刘 玲; 唐仕成; 郑 丹; 柯皓天; 吕 银

单位：1.四川省丝绸工程技术研究中心，四川成都 610031； 2.四川省丝绸科学研究院，四川成都 610031

摘要：采用正交试验设计L16(45)对桑树ISSR-PCR反应体系中的模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs和rTaq酶5个因素及反应程序中变性时间、退火时间、延伸时间和循环数进行优化分析。结果表明，各因素水平变化对反应体系的影响大小依次为DNA模板>rTaq酶>Mg2+>引物>dNTPs。最终确立了最佳反应体系，即在10 μL反应体系中，含25 ng/μL DNA模板1 μL、10×PCR buffer 1 μL、20 μmol/L引物0.2 μL、2.5 mmol/L Mg2+ 0.8 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1 μL、5 U/μL rTaq 0.1 μL。优化得到的反应程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，合适的退火温度退火45 s，72 ℃ 延伸90 s，40个循环；72 ℃延伸10 min，16 ℃保存。通过梯度PCR，确定引物ID37的退火温度为49.5 ℃。稳定性检测表明该体系能用于桑树ISSR分析。

关键词：桑树;正交试验设计;ISSR-PCR;反应体系优化