怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3基因克隆和功能分析

来源：江苏农业科学杂志2022年第第6期北京时间：

作者：尹明华; 陈佳雯; 陈瑞; 樊凡; 辜婷婷; 何思捷; 陈荣华;蔡红

单位：1.上饶师范学院生命科学学院，江西上饶 334001；2.上饶市药食同源植物资源保护与利用重点实验室，江西上饶 334001；3.上饶市三叶青保育与利用技术创新中心，江西上饶 334001；4.上饶农业技术创新研究院，江西上饶 334001；5.上饶市红日农业开发有限公司，江西上饶 334700

摘要：通过怀玉山三叶青试管苗转录组数据库筛选到怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3基因的核心片段，利用RT-PCR 技术克隆该病毒增殖蛋白3基因，并进行序列分析、亚细胞定位、器官表达分析和功能分析。结果表明：怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3基因cDNA总长度为873 bp，G+C 含量为44.22%；怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3由290个氨基酸组成，分子量33 374.79 u，等电点9.72，为疏水性蛋白；二级结构由α-螺旋(57.24%)、β-片层(10.69%)、无规则卷曲(32.07%) 构成；三级结构为单体；预测怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3主要存在质膜、液泡膜、内质网中；怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3与葡萄烟草病毒增殖蛋白3 (GenBank：XP_002275179.1、GenBank：XP_034684444.1)的同源性最高，同源性达到94.83%。通过烟草叶片亚细胞定位分析表明，烟草病毒增殖蛋白3定位于细胞质(可能包括细胞膜)和细胞核膜中。实时定量PCR结果显示，烟草病毒增殖蛋白3基因在怀玉山三叶青2个栽培种中的表达存在器官特异性，怀玉2号和怀玉1号均在叶中表达量最高；烟草病毒增殖蛋白3转基因阳性烟草的三叶青花叶病毒表达量显著高于烟草病毒增殖蛋白3转基因阴性烟草；与烟草病毒增殖蛋白3转基因阴性烟草相比较，烟草病毒增殖蛋白3转基因阳性烟草的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)、最大光化学效率(Fv/Fm)、实际光化学量子效率(ΦPS Ⅱ)、光化学淬灭系数(qP)及电子传递效率(ETR)显著下降，而非光化学淬灭系数(NPQ)显著上升。怀玉山三叶青烟草病毒增殖蛋白3具有典型烟草病毒增殖蛋白3的结构特征，氨基酸序列及核酸序列与同源物种相似度高，进化上高度保守，且可促进三叶青烟草花叶病毒的增殖，降低植株的光合作用效率。

关键词：怀玉山三叶青;烟草病毒增殖蛋白3;基因克隆;功能分析;蛋白结构