经济林研究杂志投稿格式参考范文：油茶组织培养研究进展

　　引言

　　油茶是山茶科山茶属一类木本食用油料树种的总称，是中国特有的木本油料树种，在中国已有 2300 多年的栽培历史，是世界四大木本油料作物之一。由油茶种子榨取的茶油是一种富含不饱和脂肪酸、维生素 E 和山茶苷等活性物质的优质食用油，有 “东方橄榄油” 的美称。除食用和烹调功能外，茶油及其副产品在日用化工、医药、农业和工业上都具有重要的用途，油茶是中国极具特色的经济林树种之一。

　　植物组织培养技术不仅可被用来对植物进行工厂化快速繁殖，还是生物技术育种(如基因工程、基因编辑、体细胞杂交、突变体诱导与筛选、挽救杂种胚、体外授精等)的技术基础，因此，研究油茶组织培养有着重要意义。早在 1978 年，广西林业科学研究所生理研究室颜慕勤等对岑溪软枝油茶进行了组织培养并获得成功。与此同时，其他研究者也对油茶幼胚和未成熟子叶的离体培养以及花药培养进行了探索。最近 Li 等研究了普通油茶愈伤组织诱导、悬浮培养及原生质体分离。为了给研究者提供参考，根据外植体培养类型对油茶组织培养研究进展进行了论述。

　　1 油茶芽和茎段的组织培养

　　油茶为天然杂合体，通过种子或实生苗繁殖的植株不易保持优良种性。采用油茶芽、茎尖和带芽茎段进行培养，不但无性系繁殖后代保持了母株的优良性状，而且由于存在分生组织，未经脱分化阶段形成愈伤组织就可以产生丛生芽，从而减少了变异的可能。因此，这类外植体组织培养一般用于油茶种苗快速繁殖。

　　1.1 外植体采集与表面消毒

　　组织培养中的污染和褐变是影响油茶组织培养的关键因素，油茶组织培养中外植体污染情况较为复杂，也较难控制。表面消毒的难易程度受品种、生长地区、外植体年龄、采集时间等因素影响。最简单的表面消毒方法是用乙醇和升汞的常规组合方法。

　　颜慕勤等最早采用岑溪软枝油茶成年树的腋芽进行培养，在 2—3 月份腋芽刚开始萌动、芽苞刚开始膨胀时采集外植体。采回后剥去外面几层苞片，用 75% 乙醇浸泡 12s，用 0.1% 升汞消毒 12-15min，然后用无菌水冲洗 4-5 次，在无菌条件下剥离腋芽的最后几层苞片，将腋芽切成 2-3mm 长的小段接种。

　　刘海龙等以 10 月 — 次年 1 月岑溪软枝油茶带腋芽茎段为外植体，使用毛刷刷洗后用 75% 乙醇消毒 10-15s，然后用 0.1% 升汞消毒 10-15min，污染率最低(24.5%)，其中用毛刷蘸洗洁精溶液刷洗茎段对茎段灭菌效果影响较大。1 月底 —4 月新萌枝条不带腋芽茎段较好的灭菌方法为 75% 乙醇消毒 4-7s，0.1% 升汞消毒 5-6min，污染率为 14.3%。

　　陈胜群等取小果油茶当年生带芽茎段作为外植体，用清水冲洗后，在超净工作台上用 75% 乙醇消毒 10s，然后用 1.0g/L 的升汞消毒灭菌 10min，无菌水冲洗 5 次。

　　利用乙醇和升汞的常规组合方法对油茶进行消毒的效果一般较差。流水冲洗对降低污染率有重要影响。吴正凯等取饱满顶芽用流水冲洗干净后，用中性洗衣粉溶液轻轻刷洗芽苞，再置于水龙头下用流水冲洗 2-3h，然后用 75% 乙醇快速进行表面灭菌，用无菌水冲洗 3-4 次，再用 0.1% 升汞消毒处理 5min，最后用无菌水冲洗 8-10 次。

　　黄莉雅等以油茶品种岑软 2 号和岑软 3 号的鲜嫩带芽的茎段和顶芽为外植体，用流水冲洗干净后，用中性洗衣粉溶液轻洗，再置于流水下冲洗 2-3h，接着用 75% 乙醇快速灭菌 30s，用无菌水冲洗 3-4 次，然后用 0.1% 升汞消毒 6min，在各处理中这种处理的诱导效果最好，成活率分别达 71% 和 73%。

　　刘海英取 3—5 月份当年生嫩枝，用纱布包裹脱脂棉蘸少许清水轻轻擦洗枝条表面的尘土和绒毛，再用流水冲洗干净，然后用洗衣粉溶液浸泡 10min 左右(其间不断搅拌以使清洗均匀彻底)，再用流水洗净表面洗衣粉溶液并置于流水下冲洗 2-5h，滤干水分后用 75% 的乙醇浸泡约 30s，用无菌水冲洗 3-5 遍，最后用 0.1% 升汞消毒 8min，在各处理中这种处理的腋芽启动率最高，可达 64.0%。

　　柯丹萍在用乙醇和升汞组合消毒材料(带腋芽茎段使用 70% 乙醇浸洗 30s 和 0.1% 升汞消毒 7min 的效果最好)之前，用自来水冲洗后用洗洁精溶液浸洗 15min，然后置于流水下冲洗 2-4h。

　　万珠珠等在用乙醇和升汞组合消毒材料(带腋芽茎段使用 75% 乙醇浸洗 8s 和 0.1% 升汞消毒 8min 的效果最好)之前，用自来水冲洗数次后，在洗衣粉溶液中浸泡 12-20min，再用自来水冲洗 2h。

　　何超银以当年生带芽茎段为外植体，用刷子轻轻擦洗表面的尘土和绒毛后，用洗洁精溶液浸泡 5min 左右，再用自来水冲洗 30min，用无菌水冲洗 3 次后，用 75% 乙醇处理 30s，用无菌水冲洗 8-10 次后用 0.1% 升汞处理 10min，在各处理中这种处理的效果最好。

　　代忠迪等在 2 次消毒之前，先将枝条外植体在 5℃恒温箱中低温处理 8h，再将经低温处理的油茶无性系组培外植体进行修剪，在 0.1% 的多菌灵溶液中浸泡 6min，然后用流水冲洗 5h。

　　为了降低污染率，有研究人员采用重复消毒的方式。李泽等取普通油茶当年生半木质化茎段作为外植体，用自来水冲洗 20min 左右，再用洗衣粉溶液浸泡 15min，用自来水冲洗干净后，用 75% 的乙醇浸泡 2 次(每次 30s)，用无菌水冲洗 3-5 遍，然后用 0.1% 的升汞消毒 2 次(第 1 次 10min，第 2 次 5min)，用无菌水冲洗 5 遍，最后用滤纸吸干茎段表面水分。

　　唐国涛等将大棚内 2 年生油茶扦插苗嫩枝剪去叶片后，用洗洁精溶液清洗，再用无菌水反复冲洗后，用 0.05% 升汞溶液消毒 6min，用无菌水冲洗后，再用升汞溶液重复消毒 1 次。

　　王瑞等将外植体用流水冲洗干净后，用中性洗衣粉溶液轻洗，将茎段置于流水下冲洗 2-3h，先用 75% 乙醇快速灭菌 10s，然后用无菌水冲洗 3 次，接着用 0.1% 的升汞消毒 2min，用无菌水冲洗 3 次，再用 0.1% 的升汞消毒 3min，最后用无菌水冲洗 5 次。

　　贾效成等也采用了类似的方法，取油茶顶芽或腋芽在流水下冲洗 1h，先用 75% 乙醇快速灭菌 10s，然后用无菌水冲洗 3 次，接着用 0.1% 升汞消毒 2min，用无菌水冲洗 3 次，再用 0.1% 升汞消毒 3min，最后用无菌水冲洗 5 次。

　　代忠迪等采用 2 次消毒来降低污染率：第 1 次消毒时，将带芽茎段外植体剥去外层叶鞘，用 76% 的乙醇消毒，然后用 0.2% 升汞消毒，再用无菌水漂洗，然后剥去中层叶鞘用 0.1% 升汞消毒，再用无菌水漂洗若干次;第 2 次消毒时，用 75% 的乙醇消毒 16s，无菌水冲洗 5 次。

　　在传统的 “乙醇 + 升汞” 表面消毒方法的基础上，辅以超声和低温冷处理可更好地清除外植体表面杂质，并有助于洗脱外植体内酚类物质，降低污染率和褐化率。具体做法：取油茶树当年萌发的春梢(1/3-1/2 长度的枝条基部由绿色转变为褐色)作为外植体，依次用乙醇和升汞进行表面灭菌，然后依次进行超声处理(外植体浸入无菌水中，在 300-500W、10-30℃条件下超声处理 2-4h)和无菌冷处理(外植体浸入无菌水中，置于 3-5℃冰箱中 4-6d，其间每隔 1d 更换 1 次无菌水)，得到灭菌外植体，再经升汞灭菌后，修剪成用于组织培养的外植体茎段。

　　尽管常将乙醇和升汞组合使用进行外植体表面消毒处理，但是有少数研究结果表明，乙醇和升汞处理对外植体的毒害较强，处理时间不易掌握。而以 2.5% 次氯酸钠对油茶带芽茎段和腋芽消毒 20min 的效果最好。

　　为了增强消毒效果，有研究人员采用次氯酸钠和升汞复合消毒处理。侯辛辛取当年生半硬油茶枝条的顶芽或带腋芽的茎段作为外植体，先用软毛刷蘸淡硫磺皂 0.1% 稀释液刷洗，流水漂洗 10min，用 70% 乙醇浸泡漂洗 45s 后，再用 3 种试剂进行组合消毒。结果表明：单独使用 0.1% 升汞和 2% 次氯酸钠消毒均不能起到灭菌的效果，外植体污染率达到 100%;采用 2% 次氯酸钠与 0.1% 升汞复合消毒的方法后，污染率降至 10% 以下，在此基础上将 0.4% 多菌灵添加在培养基中，污染率与诱导率均降低，但未达到显著水平。2% 次氯酸钠溶液(消毒 15min)与 0.1% 升汞(消毒 12min)联合使用为最适消毒方法。

　　在油茶组织培养过程中，即使进行了严格消毒，也会遇到严重的污染问题。因此有研究者使用抗生素、杀菌剂及防腐剂来进行抑菌。王瑞等在继代培养基中分别添加不同种类和质量浓度的抗生素和防腐剂，结果表明添加链霉素 20mg/L 的抑菌效果最佳，污染率为 0，增殖系数为 3.69，其次为青霉素 G 钠盐、青霉素 G 钠盐 + 四环素、四环素，添加多黏菌素 B 的抑菌效果最差，采用苯甲酸钠、山梨酸钾作为抑菌剂，污染率均在 92% 以上。

　　张骐飞等试验了多种消毒方法，发现如下方法效果最佳：取当年生半硬枝条在流水下冲洗 10min，用 0.1% 硫磺皂稀释液浸泡并用软毛刷蘸刷嫩枝条，用流水漂洗干净后，剪成带单个腋芽或顶芽的茎段，先用 75% 乙醇浸泡 45s 后，用 0.1% 升汞处理 12min 和 2% 次氯酸钠处理 15min 进行复合消毒，然后接种在添加 0.1g/L 的杀菌剂清菌易芽的萌动培养基上。

　　然而在培养基中添加抗生素、杀菌剂及防腐剂来抑菌，可能会影响到外植体的培养。由于野外采集的外植体不易消毒，有研究者取室内或温室内萌发的新芽作为外植体。杨育红先将明月山红花油茶多年生硬枝插入盛有湿润河沙的纸箱内，以其新萌发的侧芽为材料进行试验。将芽于流水下冲洗 1h 后，用无菌水浸泡 10min，用 70% 乙醇浸泡 15s 左右，然后用 0.1% 的升汞溶液(加少许吐温 80)灭菌 4-8min，再用无菌水清洗 4-5 次。

　　唐国涛等将扦插成活且健壮的油茶苗种植在塑料大棚内的花盆里，2 月下旬 —3 月中旬取 2 年生扦插苗带侧芽的嫩枝，剪去叶片后用洗洁精溶液清洗，再用无菌水反复冲洗，然后切成带 1-2 个侧芽的茎段，用 0.05% 升汞溶液消毒 6min，用无菌水冲洗后，再用升汞溶液重复消毒 1 次。

　　龚峥等为了降低污染率，先将植株移栽上盆，待生长稳定后移入大棚管护;采集外植体前给植株的地上部分套上透明薄膜袋，每天对全株枝叶喷 1 次多菌灵，连续喷 7d;剪取枝条后用洗衣粉溶液刷洗枝条表面，用流水冲洗 0.5h，然后浸入 0.025% 的升汞液中 20min，同时用小毛刷仔细刷洗枝条表面，流水冲洗 0.5h;在超净工作台上用 70% 乙醇浸泡 1min，用 0.1% 升汞溶液消毒 6min，用无菌蒸馏水冲洗 6 次。

　　陈春采取预培养的方式来降低污染率：取油茶优良无性系闽 43 的带腋芽茎段，用自来水冲洗 1-2h，用无菌水冲洗 2 遍，用 70% 乙醇溶液处理 30s 后立刻浸入 0.1% 升汞溶液中消毒 10-12min，或浸入 0.15% 升汞溶液中消毒 8-10min，用无菌水冲洗 5 遍后沥干，以茎尖为中心，切成 2cm 左右茎段，接种于未添加生长调节剂的 MS 培养基上，培养 20d，确定无菌后转入初代培养基上。经这样处理的外植体的存活率可达 45% 以上。

　　陈博雯等将在 4—5 月或 9—10 月采集的半木质化茎段，用 75% 乙醇消毒 5s 和 0.1% 升汞消毒 10min 后，接种在含有改良 MS 液体培养基的河沙基质中，将新萌发的嫩芽接种至 MS 固体培养基上培养 7d，可将未被污染的无菌芽用于下一步的组织培养。采用该方法不仅可降低污染率，还能有效避免褐化，有效萌芽率最高可达 90.91%。

　　刘虹将去壳油茶种子置于河沙中萌发，然后取 1 月生实生苗带腋芽的茎段来培养。虽然实生苗容易消毒，但这种组织培养快速繁殖体系本质上与实生苗繁育无差别，即繁殖的植株与亲本存在变异。

　　除消毒方法外，采集月份(即使在连续晴天时采集)可能是影响外植体表面消毒效果的重要因素。通常春季(2—3 月)和秋冬季采摘的腋芽在培养基上容易萌发，且污染现象不明显，而夏季采摘的腋芽不易萌发且易被污染，这可能与外植体的季节性带菌情况有关。

　　王以红等以 7 龄‘岑软 3 号’油茶母树的健壮嫩梢为外植体，研究不同月份采摘的样本的消毒难易程度，利用 70% 乙醇预处理 15s 和 0.1% 的升汞消毒(顶芽 6min，茎段芽 15min)，结果表明无菌活外植体得率不同，2 个高峰期分别为 4 月和 10 月，无菌活外植体得率最低的是 8 月，其次是 7 月。无菌活外植体得率与气候特点相关联，因为高温高湿环境有利于外植体表面的微生物繁殖。

　　张伟宁用与刘海英类似的方法进行试验，发现在 4—6 月、7—9 月、10—12 月 3 个时间段采集的半木质化带腋芽茎段中，以 4—6 月所采集材料的萌发效果最佳，用 0.1% 升汞处理 8min 的消毒效果最好，污染率为 7.33%，褐化率为 5.87%，萌发率为 83.11%。

　　陈博雯等的研究结果表明，带腋芽的枝条经消毒处理后，秋冬季节污染率较低，1 月份污染率最低(26.00%)，2 月份起随着当地气温回升和湿度加大，污染率逐渐升高，至 4 月份达最高(66.00%)，8 月份以后逐渐降低。11 月 — 次年 2 月的消毒效果较好。以无木质化、半木质化、木质化茎段为材料，消毒效果差异不大。

　　柯丹萍的研究结果表明，带腋芽茎段最佳取材时期为 4—6 月，此时期的材料污染率、褐化率及死亡率均较低，而腋芽萌发率最高，培养 20d 后达 75.55%。

　　1.2 外植体和培养物的褐化

　　除污染问题外，由于油茶等山茶科植物中酚类物质含量较高，酚类的糖苷化合物是木质素、单宁和色素合成的前体，所以在油茶组织培养过程中极易发生褐变，严重褐变会导致外植体和培养物的死亡。阙生全等经研究发现油茶外植体褐化程度与培养温度、培养基中生长调节剂种类(如 2,4-D、KT 和 NAA)及其浓度、无机盐含量等因素有关。较高的培养温度、培养基中较高浓度的无机盐、较高浓度的生长调节剂及木质化程度高的外植体均会促进褐化的发生，在培养基中加入吸附剂能有效抑制褐化的发生。

　　吸附剂活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及抗坏血酸(维生素 C)、硫代硫酸钠(Na2S2O3)和柠檬酸 3 种抗氧化剂对褐化的影响存在差异，以吸附剂的抗褐化效果最好，维生素 C 效果次之，Na2S2O3和柠檬酸效果较差。接种后进行暗处理，可在一定程度上减轻褐化反应。戴小英等发现在增殖过程中，以 H 改良培养基作为基本培养基可有效防止油茶外植体褐化，比在培养基中添加活性炭的效果好。蔡玲等发现在岑软 2 号油茶继代增殖培养基中添加 20-25mg/L 的维生素 C，能有效减少油茶继代芽的褐化，褐化率从 73% 降低到 4%。

　　1.3 培养基成分和培养条件

　　油茶组织培养快速繁殖研究始于 20 世纪 70 年代末 —80 年代初。颜慕勤等最早对 10 年生以上的老龄油茶的嫩茎及茎尖进行培养，发现用 SH 或 H 作基本培养基，并添加不同 NAA 和 BAP 组合，较难培养出愈伤组织，经 7-8 周培养，仅 60%-70% 的外植体长出愈伤组织，且无瘤状物及绿芽出现，但根发育良好。颜慕勤采用添加有不同种类及浓度植物生长调节物质的改良 ER 固体培养基，培养在 2—3 月采集的岑溪软枝油茶成年树腋芽。30d 后腋芽生长点开始分化丛生小苗，且芽基部能不断分化丛生苗。此后，关于油茶组织培养快速繁殖的研究报道持续出现。以油茶芽和茎段为外植体的组织培养研究大多采用 MS、WPM、H 改良、1/2MS 作为基本培养基，再添加不同类型和不同浓度的细胞分裂素(6-BA 或 BA、ZT、TDZ)和生长素(NAA、IBA、IAA)，有时会添加 GA₃ 1.0-6.0mg/L 或有机附加物如水解酪蛋白(CH)500-600mg/L，达到改善培养效果的目的。

　　目前主要采用顶芽、腋芽和带芽茎段进行油茶组织培养与快速繁殖研究。茎尖分生组织可用于脱除植物病毒和种苗快速繁殖，但由于外植体体积小，培养起来相对较困难，鲜见报道，目前仅见张桂琴等采用改良 1/2MS 培养基对大果红花油茶芽尖组织进行培养的报道。油茶组织培养快速繁殖以芽生芽途径(如丛生芽途径)为主，这种方式是以促进芽原基上腋芽的不断提早萌发来实现数量增殖。培养阶段主要分为芽诱导或萌发培养、增殖培养、壮苗培养和生根培养几个阶段，一般不涉及诱导愈伤组织及愈伤组织分化。有研究者以油茶芽和带芽茎段为外植体来诱导愈伤组织，但一般认为利用带芽的茎段和顶芽为外植体，经愈伤组织途径对油茶快繁的意义有限。不过，在其他外植体难以再生的情况下，或可将该方法与转基因技术结合使用。油茶组织培养中较为重要的 2 个阶段分别是增殖培养和生根培养。实现苗芽良好增殖是组织培养的基础，生根则关系到得到完整的再生植株及油茶组织培养快速繁殖真正进入生产实践。

　　在油茶增殖培养研究方面，戴小英等发现，以 MS、WPM 为基本培养基时，褐化严重，叶片易出现卷曲、脱落，以 H 改良为基本培养基可明显减少褐化现象，有较多有效芽产生，以 H 改良 + BA 2.0mg/L+IAA 1.0mg/L 的增殖效果为最佳。王瑞等以‘湘林 1 号’组培无菌苗为材料，研究了基本培养基(WPM、MS 和 B5)、生长调节物质类型及浓度对油茶组培苗增殖体系的影响，发现以 WPM+6-BA 5.0mg/L+NAA 0.01mg/L + 生物素 1.0mg/L 为培养基时增殖系数最高，以 MS+6BA 1.0mg/L+NAA 0.01mg/L + 生物素 0.5mg/L 为培养基时新梢生长效果最好。蔡玲等以‘岑软 2 号’组培继代芽为材料，研究了几种影响油茶组培芽增殖与生长的因素，发现在继代培养基(改良 MS+BA 2mg/L+NAA 0.2mg/L)中添加 CH 200 或 300mg/L，不仅能有效地提高继代芽增殖系数，还能促进芽生长，缩短培养时间 8-10d。

　　同时添加 20mg/L 维生素 C 能有效减少油茶继代芽褐化的发生。油茶组培继代芽培养最适宜的光照条件是在自然散射光(2000-3000lx)下培养 10d，后期移至 3000-5000lx 光照条件下再培养 20d，每瓶的有效芽可达 23 株。He 等研究了光质对普通油茶不定芽增殖的影响，发现在红蓝组合光(4∶1)条件下增殖系数最高，叶片也最厚。曾艳玲等发现，在芽诱导阶段采用白光(诱导培养基为 1/2MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.01mg/L)，在增殖、壮苗和生根阶段采用红蓝光(红、蓝为 4∶1，增殖培养基为 MS+6-BA 1.0-4.0mg/L+IBA 0.01-0.20mg/L，壮苗培养基为 1/2MS+GA₃ 5.0mg/L+IAA 0.01mg/L，生根培养基为 1/2MS)，可促进油茶带芽茎段植株再生。

　　油茶生根培养方面，颜慕勤等最早进行了探索，采用不同浓度的吲哚丁酸、吲哚乙酸及萘乙酸等生长素，及固体培养基、液体培养基、蛭石及滤纸纸桥等培养基进行生根试验。在参试的 3 种生长素中，添加 NAA 处理的生根率最高(100%)，其根系粗壮，须根多，出根快，仅培养 7-8d 即开始出根。添加 IBA 处理的生根率明显低于添加 NAA 处理，添加 IAA 处理中组培苗虽有一定的生根能力，但切口处易生愈伤组织，移栽后愈伤组织易发黑坏死，影响小苗的成活率。最佳诱导生根的 NAA 质量浓度为 8mg/L。

　　在 4 种培养基中，滤纸纸桥培养的生根效果最佳，在琼脂培养基上组培苗易生愈伤组织，在液体培养基上组培苗不但生根量少，而且多数植株仅在液面以上部分生根，液面以下部分生根量较少，呈明显的倒塔形。在其后的研究报道中，大多采用附加较高浓度的生长素(或者同时附加较低浓度的细胞分裂素)的低盐基本培养基(如 1/2MS 和 WPM 等)。吴幼媚等采用 1/2MS、1/2WPM、1/2ER 基本培养基对油茶‘岑软 2 号’无性系组培苗生根培养进行了研究，结果表明基本培养基是影响油茶组培苗生根的重要因素，其次是培养温度，植物生长调节剂是影响较小的因素。1/2ER 为油茶组织培养最适基本培养基，ABT6 0.5mg/L+IAA 2.0mg/L+NAA 0.8mg/L 为最优的生长调节剂浓度组合，室温(28±2)℃、光强 2500-3500lx 有利于油茶组培苗生根。

　　油茶组培苗生根存在较大的难度，采用含 NAA 和 IBA 的常规生根培养基进行培养时，生根苗大多仅 1 条主根，须根较少。唐国涛等以 1/4MS、1/2MS、MS、B5 等基本培养基配以 NAA、IBA、IAA、GA3、2,4-D 进行生根试验，经过多次多组合试验均未能筛选出适合油茶生根的培养基。龚峥等发现采用常规的培养方法无法诱导广宁红花油茶植株生根，但采用针对调节极性表现的程序系列培养，可促进不定根分化，提高生根率，但作者未提供技术细节。谭晓风等发现在 1/2MS+IBA 0.5mg/L 的琼脂培养基中加入珍珠岩，使油茶根系能够充分呼吸，大大提高了油茶生根率和移栽成活率。制备方法：配制 1/2MS+IBA 0.5mg/L 琼脂培养基(琼脂为 7-10g/L，pH 5.0-5.5)，然后用网兜包好粉碎的珍珠岩，置于融化的培养基中，使珍珠岩充分吸收培养基，稍沥干后灭菌即可。

　　鉴于在常规生根培养基上组培苗生根存在困难，研究者多采用两步法促进组培苗生根，即首先在高浓度的生长素培养基上诱导生根，然后转接到无任何生长素的培养基上进行根的发育，或者首先用高浓度的生长素溶液浸泡处理苗芽基部，然后进行扦插(即瓶外生根法)。范晓明采用 1000mg/L 的 IBA 处理芽苗基部 5s，然后转入 1/2MS 空白培养基进行培养。陈永忠等此外，为探明油茶组培苗生根机制，王瑞等研究了油茶组培苗生根过程中生理生化指标的变化，陈晓明等采用 1000mg/L 的 IBA 溶液浸泡苗基部 10s，然后接种在 1/4MS+AC200 培养基。张伟宁发现瓶内生根最佳培养基为 1/2MS+NAA 2.0mg/L + 蔗糖 20g/L，将小苗茎段基部在 1000mg/L 的 NAA 溶液中蘸 20s，然后在 1/2MS 培养基中培养的效果最佳。

　　袁德义等发现试管苗经 1g/L 的 IBA 处理 5s 后，转入 1/2MS 空白培养基培养，50d 后生根率高达 88.3%。陈永忠等采用瓶外生根方法(将生根和移栽步骤合二为一)可提高组培苗的生根率和成活率。具体方法：将组培苗从培养瓶中取出后，在 0.1% 瑞毒霉 - 锰锌溶液中浸泡 2-4min 进行消毒，之后将组培苗基部在 500-8000mg/L KIBA 溶液中浸泡 3-4s，然后扦插在由黄心土、炭化谷壳灰、细沙按体积比 1∶2-3∶1 配制而成的基质上，最后用透光薄膜封口。刘虹通过对比瓶内生根和瓶外生根方法，发现瓶内生根处理的生根率较低，根系脆弱，移栽成活率也较低，瓶外生根(100mg/L NAA 浸泡幼苗 45min 后扦插移栽)处理的生根率较高，且根系粗壮，移栽成活率高。唐国涛等以细沙作基质(将湿润的细沙装入玻璃瓶中，厚度 2.5-3.0cm，然后经高压灭菌处理)，将培养 60d 以上、长 5cm 的木质化油茶茎段(切去基部 2cm 以内的叶片)基部在 0.1mg/L、深度约 2cm 的 GGR(6 号生根粉)溶液中浸泡 12h，然后进行扦插，生根率达 95%。

　　唐国涛等认为油茶组培苗生根较为困难，可能与诱导和增殖培养过程中 6-BA 和外源植物生长调节剂在油茶组培苗中的累积有关，将继代培养的丛生芽转接到无 6-BA 和外源植物生长调节剂的 MS 培养基中培养，可有效降低 6-BA 和外源植物生长调节剂累积效应对苗木产生的影响。戴小英等比较了油茶组培苗的根系质量及移栽成活率，发现试管外生根方法更具优势。传统试管内诱导根系需 40d 以上，且生根率和根数量不理想，而采用高浓度生长调节剂进行短期诱导(在 1/2H 改良 + NAA 3.0mg/L 培养基中培养 10d)后，蘸取生长调节剂 GGR 200mg/L，直接扦插到黄心土和草木灰(6∶1)基质上，30d 后组培苗可在基质中产生根系。闫晓芳等采用 1.5-3.0g/L IBA 诱导处理芽苗 3-30min 后，接种到 1/2MS + 多效唑 2-6mg/L 培养基上进行生根培养，可促进油茶组培苗生根。为了绕过油茶组培苗生根困难环节，有研究者对增殖芽进行壮芽和炼芽后，将其作为接穗，以种子萌发的胚芽为砧木，进行芽苗砧嫁接研究了油茶组培苗生根过程中过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和吲哚乙酸氧化酶(IAAO)等的活性变化。

　　2 油茶胚、子叶、叶片等的组织培养

　　采用油茶胚、子叶、叶片等外植体进行培养，可以经直接体细胞胚胎发生或直接器官发生途径实现植株再生(即不经过愈伤组织阶段)，也可经愈伤组织阶段通过间接体细胞胚胎或间接器官发生途径实现植株再生。特别是间接体细胞胚胎或器官发生途径需要首先诱导产生胚性愈伤组织，再经体细胞胚胎或器官发生途径产生完整植株，最有利于进行遗传转化和基因编辑，因此受到许多研究者的重视。此外，采用幼胚培养产生完整植株，可以在远缘杂交中挽救杂种胚，对于油茶远缘杂交育种具有重要意义。以油茶胚、子叶、叶片为外植体进行培养时，大多以 MS 为基本培养基，采用不同比例的细胞分裂素(6-BA 或 BA、KT、ZT、TDZ)和生长素(NAA、IBA、IAA)组合。与培养芽和带芽茎段不同，有研究者采用生长素 2,4-D 来诱导胚、子叶、叶片产生愈伤组织。

　　2.1 油茶胚和子叶的组织培养

　　油茶胚和子叶培养有 2 种情况，一种是取成熟胚和子叶进行培养，另一种是取未成熟胚和子叶进行培养。由于油茶种子十分坚硬，难以从成熟种子中分离胚和子叶，因此，一般先将种子表面消毒后进行无菌萌发，然后取子叶和胚轴进行培养。从正在发育的种子中切割分离未成熟胚(幼胚)和子叶相对容易，因此，通常取幼果或幼嫩种子进行表面消毒，然后取胚、子叶和胚轴进行培养。与大田植株的叶片相比，合子胚(包括子叶和胚轴)的表面消毒较为容易，而且培养反应能力更强，更易培养。但是油茶通常为异株授粉，合子胚来源于母株的有性杂交后代，与母株在遗传上是异质的。

　　颜慕勤首先报道在油茶种子的子叶基部可诱导体细胞胚状体发生。其采用 1-2 月龄无菌实生苗的节间及下胚轴作为外植体，可诱导出愈伤组织和小瘤状物。用 SH 或 H 作为基本培养基，附加 NAA 0.5mg/L 和 BAP 0.5mg/L 最有利于小瘤状物的产生;再加入 10mL 油茶子叶浸出液可以把瘤状物的产生率从 1% 增加至 10%。将外植体转移到无任何生长调节剂的 SHO 培养基上，会进一步长出不定芽及小苗。其后，彭秋发等采取油茶种子无菌萌发后的子叶等外植体进行培养，林青、Li 等将成熟种子的种仁进行表面消毒，然后切取油茶成熟种胚(带有胚乳组织)接种在 1/2MS 培养基中获得无菌苗，然后取无菌苗的子叶、下胚轴进行不定芽诱导。

　　隆振雄最早对油茶幼胚进行培养，将油茶幼果进行常规表面消毒(先用 70% 的乙醇消毒 30s，再放入 0.1% 的升汞中消毒 30min，然后用无菌水反复冲洗 3-4 次)后，用无菌刀切割并剥出幼果种胚，再割成长 2-3mm 的组织块接种。隆振雄采用N6、White 和 MS 基本培养基进行试验，结果表明在 White 培养基上诱导效果良好，其次是 MS 培养基。White+BA 0.5mg/L+NAA 0.05mg/L 或 White+2,4-D 0.02mg/L+NAA 0.05mg/L+BA 0.5mg/L 培养基对油茶幼胚愈伤组织及胚状体的诱导效果较好。在同一诱导培养基上，油茶幼胚组织的胚状体诱导率与加入钼酸铵量呈现正相关，在诱导培养基中加入 10mg/L 钼酸铵，诱导率约提高 1.6%。幼胚发育时期从 3 月油茶幼果开始膨大时起，至 9 月中旬茶果即将成熟时止。在幼胚尚未形成时取样培养，难以获得成功;只有在幼胚长 2-3mm 时取样培养，才能诱导出愈伤组织，并产生胚状体。油茶幼胚胚状体的最佳芽分化培养基为N6+IAA 0.5mg/L+BA 2.0mg/L+LH(水解乳蛋白)500mg/L。

　　分化植株的频率在较大程度上取决于生长调节剂种类和比值，如在N6分化培养基中，细胞分裂素与生长素的比值为 4 的条件下，添加 BA 比添加 KT 的分化效果好，分化植株的频率高。为了保持优良组合的杂交优势并扩大再繁殖，卢天玲对油茶未成熟子叶和幼胚进行了离体培养，采用附加 2mg/L NAA 和 4mg/L BA 的 MS 基本培养基诱导愈伤组织，然后转入减少或无生长素及提高细胞分裂素的培养基上分化丛生苗，也可以在再分化培养基上直接诱导丛生苗。生长素 NAA、IAA 对愈伤组织的诱导与分化均有良好效果，BA、ZT、NAA 的适当配比是诱导丛生小苗的重要因素。

　　只有绿色或黄绿色的愈伤组织才能分化。培养基含 2,4-D 或 5% 以上的蔗糖均不利于愈伤组织绿化，也不利于分化。6 月之后，油茶种子的胚乳已完全消失，以此时的子叶和幼胚作为外植体较易诱导成苗。韩春霞以六倍体‘华硕’自然授粉后 7—8 月份的幼胚为外植体，发现在 WPM + 蔗糖 30g/L + 琼脂 8g/L+NAA 1.5mg/L+6-BA 2.0mg/L 培养基上，幼胚成苗效果最佳。毕方铖等采用普通油茶优良无性系‘湘林 4 号’油茶幼果为材料，进行表面消毒后，直接剥去外层种皮，取出幼胚，将子叶基部切成 0.3~0.5cm3的组织块接种。此后，范晓明等、胡玉玲等、庞芳芹等、侯辛辛、王江英等采取类似方法对果实进行灭菌，然后取出种子，分离幼胚和子叶进行培养。张智俊、张智俊等将油茶未成熟果实进行表面消毒后，剥去外种皮，置于无生长调节剂的 MS 培养基上进行萌发培养，然后将子叶切成小块作为外植体，结果表明附加适量的 2,4-D 和 KT 有利于胚性愈伤组织的形成，油茶胚状体起源于单细胞原胚或者多细胞团，多从表皮细胞的胚性愈伤组织诱导产生。

　　2.2 油茶叶片的组织培养

　　与合子胚(包括子叶和胚轴)相比，以在无性繁殖植株上采集的叶片进行组织培养，其再生植株理论上与母株在遗传上是同质的，且油茶叶片来源丰富，容易取材。但是叶片随其生长部位和发育年龄不同，表达细胞全能性的能力是不同的，培养反应性比合子胚差，从大田采集的叶片还存在难消毒和容易褐化的问题。为了解决表面消毒难的问题，有研究者取组培苗的叶片或实生苗的叶片培养，但后者会带来遗传上的异质性问题。

　　王瑞等取油茶优良无性系‘湘林 1 号’和‘湘林 4 号’当年生枝条上完全展开的嫩叶进行愈伤组织诱导，发现 2 个品种愈伤组织的萌发时间以及诱导率差别较大。‘湘林 1 号’以 MS+IBA 0.01mg/L+KT 0.5mg/L+2,4-D 0.5mg/L+NAA 2.0mg/L 为培养基最佳，‘湘林 4 号’以 IBA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L+KT 1.0mg/L+NAA 2.0mg/L 为培养基最佳，对于‘湘林 4 号’来说，在 4 种基本培养基(MS、WPM、N6、改良 ER4)中，以改良 ER4 为佳。此外，低温预处理 5~10d 有助于愈伤组织的诱导，光照条件(暗培养较好)和叶片部位(叶柄较差)均对愈伤组织的诱导有影响。袁德义等通过直接器官发生途径使叶片外植体产生不定芽，蔡冬元则以间接器官发生途径使外植体产生不定芽。黄武以幼嫩枝条顶端嫩叶为外植体，用 MS + 毒莠定 16mg/L+CuSO42μmol/L 诱导出白色松脆的愈伤组织，用 WPM+NAA 1mg/L+6-BA 1mg/L 诱导出绿色致密的愈伤组织，用 WPM+KT 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L 诱导出结节性愈伤组织。对培养基进行优化后，可获得 4 种类型的愈伤组织。

　　在 MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.1mg/L+ZT 0.5mg/L+TDZ 1mg/L 上可获得结构松脆的白色愈伤组织，转接到 WPM+NAA 2mg/L+ZT 2mg/L 培养基上 6 周后可形成黄色胚性愈伤组织，再转接到 MS+NAA 0.5mg/L+2,4-D 2mg/L 培养基上 8 周后可分化出体细胞胚，体细胞胚在 MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L 培养基上 4 周后可产生绿色子叶。子叶在 MS+6-BA 1mg/L 培养基上可直接分化成芽，将子叶切碎后转接到 MS+6-BA 1mg/L+NAA 0.5mg/L 培养基上可脱分化形成愈伤组织;剥离出胚性愈伤和体细胞胚，在 MS+NAA 0.5mg/L+2,4-D 2mg/L 培养基上继代增殖，可实现体细胞胚循环培养。王瑞等以油茶优良无性系‘湘林 1 号’的无菌组培苗叶片为外植体，比较分析了蔗糖、果糖、葡萄糖、白糖和麦芽糖 5 种碳源以及不同蔗糖浓度对油茶愈伤组织诱导的影响。结果显示在碳源中蔗糖(30mg/L)处理的诱导率最高(100%)，以白糖为碳源诱导率达到 93.3%，其可作为替代碳源。

　　以叶片为外植体进行培养时，酚类物质会从叶片切口处释放到周围的培养基上，导致叶片褐化死亡，愈伤组织的诱导率降低。刘海英发现低温预处理 7d 能较好地抑制叶片愈伤组织褐化，张伟宁、柯丹萍的研究结果表明消毒后暗培养 7d 能有效抑制褐化现象。黄国文等以油茶叶片为外植体，研究了诱导愈伤组织过程中降低外植体褐化率和提高诱导率的方法，发现在水中弱光培养枝条 1~2d，0.3g/L 的维生素 C 溶液漂洗外植体 2~3min，在培养基中添加 1.0g/L 活性炭和 0.3g/L 维生素 C 等方法均可以显著减少外植体的褐化。优化的培养基 WPM+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 1.5mg/L + 蔗糖 15.0g/L + 葡萄糖 15.0g/L + 琼脂 6.5g/L + 活性炭 1.0g/L + 维生素 C 0.3g/L 可提高外植体的愈伤组织诱导率，减少外植体褐化。黄武消除越南油茶外植体褐化的办法是采用在无生长调节剂的 MS 基本培养基上预培养 7d，以释放酚类物质，再转移到添加生长调节剂的培养基上暗培养进行脱分化。

　　3 油茶花药的组织培养

　　花药培养是获得单倍体植株的有效手段，是植物单倍体育种和倍性操作的重要方法。花药培养的表面消毒相对容易，采集适宜花粉发育时期的未开放花苞，经低温预处理后除去表面几层花瓣，经常规消毒即可。如隆振雄用 70% 乙醇消毒 0.5min，然后用 0.1% 升汞中灭菌 10min，无菌水漂洗 3~4 次。

　　3.1 适宜的花粉发育时期

　　隆振雄最早报道对油茶花药进行培养，他发现在不同花粉发育时期进行取样，花药愈伤组织的诱导率存在明显差异，以四分体期花药愈伤组织诱导率最高(46.43%)，单核晚期次之(21.67%)，双核初期花药则较少产生愈伤组织(4%)。闻丽取大部分小孢子处于单核时期发育阶段的花蕾作为外植体来源，对 8 个油茶物种的花药进行了培养，发现盛花初期所采样品的愈伤组织诱导率高于盛花末期所采样品的诱导率。丁植磊取小孢子发育处于减数分裂单核靠边期的材料，对 12 个油茶物种的花药进行培养，结果表明在幼壮龄油茶植株背阴面、枝条下部以及始花期采摘花蕾，可获得较高的油茶愈伤组织诱导率和继代培养增殖效果。范晓明等以攸县油茶花药为外植体进行组织培养，发现花粉四分体时期为油茶花药愈伤组织诱导的最佳时期，取幼壮龄油茶植株背阴面、枝条下部以及始花期花蕾较为适合。侯辛辛认为处于单核靠边期的花药为诱导油茶胚性愈伤组织的合适外植体(花蕾横纵长度比在 0.53 左右)。

　　3.2 低温预处理

　　对于大多数植物花药培养而言，低温预处理有助于提高花药愈伤组织的诱导率。低温预处理同样可提高油茶花药愈伤组织的诱导率。李建安等的小果油茶花药培养结果表明，不同低温(4℃)预处理时长对愈伤组织诱导率有一定的影响，预处理 12、6、0d，愈伤组织诱导率分别为 2.99%、2.68% 和 0.83%。说明经过一定时间的低温预处理可提高小果油茶的花药愈伤组织诱导率。闻丽于 10 月上中旬 —1 月下旬摘取普通油茶、小果油茶、攸县油茶、浙江红花油茶、广宁红花油茶、腾冲红花油茶、越南油茶、宛田红花油茶 8 个品种的花蕾作为材料进行花药培养，发现不同物种、低温(4℃)预处理时长，油茶花药的愈伤组织诱导效果不同。低温预处理有利于油茶花药愈伤组织的诱导，但不同油茶物种最适宜的预处理时间不同，普通油茶为 10d 左右，攸县油茶为 5~10d，越南油茶为 15d 左右，浙江红花油茶为 10d 左右，广宁红花油茶为 15d 左右，腾冲红花油茶为 10d 左右，宛田红花油茶为 15d，小果油茶花药经过低温预处理其诱导率未明显提高，而普通油茶和小果油茶的花药愈伤组织诱导效率均达到了 70% 以上。范晓明等发现攸县油茶花药低温预处理时长应在 10d 以内。

　　3.3 培养基和培养条件

　　隆振雄研究了N6、MS、B5、MB、Miller 和 White 等基本培养基对油茶花药培养效果的影响，并在培养基中添加了 2,4-D 0.5mg/L、NAA 0.2mg/L、BA 0.2mg/L、KT 1.5mg/L，结果表明 MB、N

　　6和 White 较为适宜用于油茶花药培养，诱导率高，而且所诱导的愈伤组织结构紧密，呈圆形瘤状物，乳白色，质量较好。以蔗糖为碳源较好。采用器官分化培养基N6+BA 2mg/L+IAA 0.5mg/L+5BR 0.5mg/L + 核黄素 1mg/L + 蔗糖 3% 进行分化培养时，愈伤组织仅出现绿色芽点，未能再生完整植株。进行花药愈伤组织诱导时不加人工光照，但培养室内有自然散射光;在进行愈伤组织器官分化时，置于 2000lx 光照条件下进行，每日补照明 10~12h。

　　李建安等在对小果油茶和广宁红花油茶的花药进行离体培养时，发现广宁红花油茶花药具有较强的愈伤组织诱导能力，而小果油茶花药褐化严重，诱导率较低。在最佳愈伤组织诱导培养基 MS+2,4-D 0.6mg/L+NAA 0.4mg/L 和B5+2,4-D 1.2mg/L+6-BA 0.4mg/L 上，广宁红花油茶愈伤组织诱导率高达 94.67% 和 91.00%，小果油茶则分别为 8.00% 和 3.34%。MS 培养基有利于愈伤组织生长增殖。

　　闻丽等在进行油茶花药愈伤组织诱导时，发现在 MS、B5、N6、Miller 基本培养基中，MS 的诱导效果最好。2,4-D 0.5mg/L 和 6-BA 0.2mg/L 为较佳的生长调节剂组合。3%~4% 蔗糖溶液的愈伤组织诱导效果较好。在黑暗条件下培养可以提高油茶花药愈伤组织的诱导率。

　　丁植磊等发现在油茶 12 个物种花药中，基因型不同，愈伤组织诱导率也不同。以小果油茶、普通油茶、短柱油茶、浙江红花油茶、茶陵红花油茶、多齿红花油茶的愈伤组织诱导率较高(40%~70%)，小果油茶、普通油茶的愈伤组织诱导率甚至高达 70%。但红皮糙果油茶、广西糙果油茶、茶陵红花油茶、多齿红花油茶、攸县油茶的花药褐化较严重。在继代培养中 6-BA 和 KT 均有较好的促进作用，小果油茶、普通油茶、短柱油茶、浙江红花油茶、茶陵红花油茶、多齿红花油茶的愈伤组织均增殖较好。MS 培养基适合油茶不同物种愈伤组织的诱导;在 MS、N6培养基上能获得较好的愈伤组织继代增殖效果(均附加蔗糖 35g/L，琼脂 7g/L，pH 值 5.8)。NAA 0.5mg/L+2,4-D 0.6mg/L 及 6-BA 0.2mg/L+2,4-D 0.5mg/L 适合用于不同物种白花油茶与红花油茶花药愈伤组织的诱导;MS 培养基附加 NAA 0.5mg/L+ZT 0.5mg/L、NAA 0.5mg/L+KT 0.5mg/L 或 6-BA 1.5mg/L+NAA 1.0mg/L 均能获得较好的愈伤组织增殖效果。添加 0.2%~0.8% 活性炭对于油茶花药愈伤组织有抑制增殖作用;在愈伤组织继代培养和增殖培养中，当添加 BA 0.4mg/L、NAA 1.0mg/L 时，活性炭能起到较好的防止褐化和促进生长的作用。暗培养 5~10d 改善愈伤组织继代增殖的效果较好。颜色嫩绿纯正、质地致密稍硬的愈伤组织的增殖效果最好。继代时间以 (30±5) d 为宜，继代 6 次后愈伤组织增殖效果较差。

　　叶思诚等对浙江红山茶花药进行离体培养时，发现 2,4-D、KT(6-BA)、TDZ 之间存在协同作用，通过特定组合能够更容易诱导愈伤组织产生，提高愈伤组织诱导率。适当增加蔗糖的质量浓度(30~80g/L)，提高渗透压，能够提高愈伤组织的诱导率。此外，CH、LH、脯氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺的添加也可以促进愈伤组织的诱导、体细胞胚的形成和生长。

　　范晓明等将接种的攸县油茶花药置于 (25±3)℃条件下暗培养 25d 后，再移至自控光照培养架上培养，光照时间 12h/d，光照强度 2000lx，发现培养基添加物以AgNO3效果最优，诱导率最高为 81.02%，继代增殖培养基配以 MS+6-BA 2.00mg/L+NAA 0.05mg/L 为最佳。

　　侯辛辛的研究结果表明适宜海南油茶花药胚性愈伤组织诱导的初代培养基为改良 MS+2,4-D 2.0mg/L+ZT 2.0mg/L，胚性愈伤组织在 1/2 改良 MS+6-BA 2.0mg/L+ZT 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L 培养基中暗培养可有效增殖，并分化出体细胞胚，体细胞胚在 1/2 改良 MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L 培养基上可诱导成熟和萌发形成再生植株，但诱导率较低，培养基配比仍有待进一步优化。其花药培养条件为暗培养，温度为 (25±2)℃。在暗培养条件下愈伤组织快速增殖，在光照培养下愈伤组织增殖缓慢，且大部分呈现褐色或坏死状态，仅少部分为胚性愈伤组织状态。暗培养条件对胚性愈伤组织维持和增殖更有利。5μmol/L + 谷氨酰胺 800mg/L + 丝氨酸 200mg/L，‘华金’‘华硕’‘华鑫’花药胚性愈伤组织的诱导率分别是 36.00%、56.33%、8.25%。

　　此外，靳皓然探索了采用油茶未授粉子房和胚珠诱导单倍体，发现诱导子房愈伤组织的最适培养基为 MS + 蔗糖 60g/L + 琼脂 7g/L+NAA 0.3mg/L+TDZ 2.0mg/L，未授粉胚珠诱导愈伤组织的最适培养基为 MS + 蔗糖 40g/L + 琼脂 7g/L+NAA 1.0mg/L+TDZ 2.0mg/L。

　　3.4 褐变问题

　　油茶花药组织培养同样存在褐变问题，因此，有效控制褐变成为油茶花药培养的关键。李建安等发现小果油茶和广宁红花油茶的花药愈伤组织诱导能力差异十分明显，广宁红花油茶花药愈伤组织容易诱导，而小果油茶诱导困难。小果油茶花药在接种后第 3 天出现明显褐化，10d 后所有花药均呈黑褐色，而广宁红花油茶花药接种后未出现褐化现象，因此花药褐化是小果油茶花药愈伤组织发生的限制因素。闻丽的研究结果也表明，不同油茶物种花药的褐化程度不同。愈伤组织诱导率较高的普通油茶和小果油茶的花药褐化程度较低，越南油茶花药褐化程度也相对较低，其次是广宁红花油茶、腾冲红花油茶、宛田红花油茶、浙江红花油茶，最高是攸县油茶。一般褐化情况越严重，愈伤组织诱导率越低。预处理时长对组织褐化基本上无影响。油茶花药褐化愈伤组织的组织化学分析结果表明：无褐化愈伤组织的细胞含淀粉、脂滴相对较多，这些物质在褐化愈伤组织细胞的含量相对较少;褐化愈伤组织细胞中单宁类物质、过氧化物酶含量相对较多，而在无褐化愈伤组织细胞中含量相对较少。

　　4 展望

　　油茶种苗繁育方法包括实生繁育、扦插繁育、嫁接繁育和组织培养繁育。虽然研究结果表明经组织培养产生的再生植株能够保持原无性系的优良特性，但由于油茶外植体表面消毒困难、褐化严重及生根困难等，还未能实现利用组织培养技术进行工厂化快繁。消毒困难和褐化问题相对容易解决，而生根困难则主要是由于木本植物本身的生理状态，外植体培养反应性差。在采集外植体时，尽量采集树体下部的萌条(更接近幼态)，或采取措施促进主茎基部萌芽，然后再取主茎基部产生的萌条来培养。

　　由于油茶组织培养和植株再生比较困难，在利用组织培养技术进行油茶生物育种方面，目前仅见 Li 等报道普通油茶叶肉原生质体分离和 PEG 介导的瞬时转化方法和 Lin 等报道普通油茶花瓣原生质体分离和 PEG 介导的瞬时转化方法，尚未见油茶稳定转化方法的报道。目前，有关油茶基因组组装和测序、重要性状的关键基因克隆方面的研究取得不少进展。未来油茶基因工程与基因编辑的应用仍将有赖于油茶组织培养和植株再生技术的突破，因此应进一步加强油茶组织培养研究。

刘进平;胡海燕;吴文嫱;黄小龙;黄东益;王 健;赖杭桂,海南大学;南繁学院;热带油茶海南省工程研究中心;海南大学热带农林学院;海南大学生命健康学院,202404