1种简单快速高效的双靶点CRISPR/Cas9载体构建方法

来源：华中农业大学学报杂志2020年第3期北京时间：

作者：张扬，黄维峰，周菲，林拥军

摘要：基于Golden Gate载体构建过程，对CRISPR/Cas9双靶点敲除技术的载体构建系统进行了优化，建立了一种简单快速高效且无PCR扩增的双靶点CRISPR/Cas9载体构建方法。在本方法中，只需将设计好的2个靶点DNA小片段和1个外源片段用T4 DNA连接酶构建到CRISPR/Cas9载体上即可。用本方法对10个已报道的水稻基因构建了20个双靶点CRISPR/Cas9载体，阳性率为100％，测序结果显示无突变。该载体系统非常适合大批量CRISPR/Cas9载体的构建，同时也为其他植物中构建双靶点CRISPR/Cas9载体提供借鉴。

关键词：水稻; CRISPR/Cas9; 基因敲除; 基因编辑; 双靶点; 载体构建

基金资助：国家重大科技专项（2016ZX08001-001）