华南理工大学学报·自然科学版杂志投稿格式参考范文：低氧环境对组织工程血管移植物胶原蛋白含量的提升作用

　　引言

　　近年来，人类疾病谱的改变造成心血管疾病治疗病患增多及需要血液透析的人群增大，临床需要实施血管移植的情况越来越多。目前常使用自体血管进行血管移植，其不存在免疫排斥反应，然而患者大多高龄和自身可用于移植的血管数有限，因此限制了这种方法的使用。合成高分子材料如膨体聚四氟乙烯等制成的血管移植物，具有良好的力学性能和生物相容性，已成功应用在大口径血管移植中。但是合成材料在用于小口径血管(直径 1~6 mm)移植时易产生感染、移植物阻塞和血栓形成等问题。组织工程血管移植物(TEVG)在成分和生物力学性能方面已经可以接近天然血管，并证实其植入人体后可被宿主重塑为自体组织。目前最成熟的获取方法是利用体外血管生物反应器技术，在可降解支架材料上接种血管平滑肌细胞，通过 8 周的三维力学刺激环境培养成以胶原蛋白为主要成分的管状组织。

　　体外组织工程的培养有 3 个基本要素：种子细胞、支架材料和环境信号。环境信号包括物理条件、离子浓度、细胞因子等，这些通常使用特定的生物反应器和培养基来提供。氧气浓度是体外细胞培养时一种重要的环境影响因素，尽管已经有多种生物反应器被设计用于 TEVG 的培养，但鲜有关于氧气浓度选择的研究。常规培养所用的氧浓度为大气氧分压(21%)，然而生理状态下动脉的血氧分压在 9.3~13.3 kPa(约 9%~13%)，静脉的血氧分压约为 5.3 kPa(约 5%)，远低于常氧分压。生理条件下组织的低氧浓度环境，可以为组织工程技术提供参考。已有研究表明低氧可以刺激细胞外基质(ECM)相关蛋白的表达，影响细胞的增殖、分化等功能。血管平滑肌细胞(VSMCs)对于氧气有特定的响应，在肺动脉高压中缺氧会引起肺动脉平滑肌细胞过度增殖和迁移，并促进胶原蛋白沉积和交联增强，导致血管壁增厚。这为新型组织工程血管的发展提供了新的路径。

　　胶原蛋白是 ECM 的主要成分，在组织中起到提供结构支撑和拉伸强度的作用，并且调节细胞的粘附和迁移。胶原蛋白的种类和含量直接影响了各种间充质组织(例如血管壁)的力学强度。在血管壁中，最主要的胶原类型是 Ⅰ 型胶原蛋白(ColⅠ)和 Ⅲ 型胶原蛋白(ColⅢ)，而理想的 TEVG 也需要有足够的高质量 Ⅰ 型和 Ⅲ 型交联胶原纤维以支持拉伸、缝合和搏动等力学行为，从而在血管移植后顺利发挥作用。因此研究 ColⅠ 和 ColⅢ 的分泌和胶原纤维的形成对于 TEVG 的构建具有十分重要的意义。

　　本研究拟采用不同氧气浓度培养 VSMCs，通过评估增殖活性来确定细胞培养的最优氧气浓度;分析常规氧浓度和低氧浓度下胶原蛋白的分泌情况以及沉积在细胞层中的胶原含量;在聚乙醇酸(PGA)支架上开展 TEVG 三维培养，探讨低氧条件下的三维培养效果，以期进一步获得一种新型小口径组织工程血管培养技术。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要试剂和仪器

　　杜氏改良 Eagle 培养基 / F12(DMEM/F12)培养基和胎牛血清(FBS)购自 Corning 公司;无纺布聚乙醇酸(PGA)购自 Biofelt 公司;CCK8 细胞活性检测试剂盒购自 Dojindo 公司;羟脯氨酸检测试剂盒购自 Solarbio 公司;RNA 提取试剂盒购自 Beyotime 公司;逆转录试剂盒和 SYBR Green 染料法 qPCR 试剂盒购自 Yeason 公司;上样缓冲液和抗氧化剂购自 Invitrogen 公司;4% 多聚甲醛购自 Leagene 公司;兔多克隆 ColⅠ 抗体购自 Proteintech 公司;兔多克隆 ColⅢ 抗体购自 Abcam 公司;羊抗兔 HRP 偶联二抗购自 Abbkine 公司。

　　1.2 细胞获取和培养

　　血管平滑肌细胞取自新生小牛的胸主动脉，分离血管壁获得血管中膜组织后用组织块培养法得到原代 VSMCs，后续实验所用的细胞代数为 P2-P5 代。使用含 15% FBS 的 DMEM/F12 培养基培养细胞。常氧组的细胞在含(体积分数)CO₂的普通 CO₂培养箱中培养;低氧组的细胞则在可设置不同氧气含量的三气培养箱中培养，其他条件与常氧组一致。

　　1.3 TEVG的培养

　　选用无纺布的 PGA，裁剪缝合成管状后作为三维支架材料。用 1 mol/L NaOH 碱化处理 PGA，再用无菌水清洗 3 遍。随后用 95% 乙醇浸泡消毒，风干待用。将以 7×10⁶个 /cm 的细胞密度接种于 PGA 上，完成接种后静置于 37℃的 CO₂培养箱 3h 等待细胞贴壁，然后加入适量培养基进行培养，每 3d 更换一次培养基。对照组在普通的 CO₂培养箱中培养 30 d，低氧处理组在 7% 氧气的三气培养箱中培养 15 d 后转移到常氧继续培养 15 d。

　　1.4 细胞活性增殖检测

　　采用 CCK8 试剂盒检测细胞活性，不同天数下细胞活性的变化反映了细胞的增殖速率。在 96 孔板中接种 VSMCs，分别在常氧、2%、5%、7%、10%(体积分数，下同)氧气条件下进行培养，每组设置 5 个复孔。在每个检测时间点去除培养基，用 CCK8 试剂与生长培养基按体积比 1∶10 混合后加入每个孔中，置于 CO₂培养箱或三气培养箱中孵育 3 h。孵育结束后，用酶标仪检测在 450 nm 处的吸光度。分别检测培养 0、1、3、5、7 d 的细胞活力。

　　1.5 总胶原含量的检测

　　羟脯氨酸是胶原蛋白中的一个主要成分，其含量与胶原蛋白的总量成正比，通过测定样品中羟脯氨酸的含量，可以间接推算出胶原蛋白的总量，因此总胶原含量用样品中含有的羟脯氨酸含量表示。使用羟脯氨酸(HYP)含量检测试剂盒检测样品中的羟脯氨酸含量。培养完成后的细胞层或组织用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后用 6 mol/L 的 HCl 溶液在 110 ℃下消化 16 h，待冷却后用 10 mol/L 的 NaOH 溶液调节 pH 至中性，即为消化液。将待测的消化液或羟脯氨酸标准品按试剂盒说明处理后在酶标仪下检测 560 nm 的读数，计算出羟脯氨酸的含量。细胞培养基则加入等体积的 12 mol/L HCl 溶液，在 110 ℃下消化 16 h，随后按同样步骤检测溶液中的羟脯氨酸含量。

　　1.6 qPCR分析胶原基因表达

　　细胞分别在常氧和 7% 氧气条件下培养 3 d 后，使用 RNA 提取试剂盒提取细胞总 RNA，再用逆转录试剂盒将 RNA 逆转录为 cDNA。然后使用 SYBR Green 染料法 qPCR 试剂盒检测胶原基因 mRNA 的 Ct 值。所有基因的值以 β-actin 作为内参进行归一化，使用 2^-ΔΔCt 方法计算相对表达定量。

　　1.7 蛋白免疫印迹

　　在每次更换培养基前取样细胞培养基，取等量培养基样品分别加入上样缓冲液和抗氧化剂在 97 ℃变性 10 min 之后，在 4%~12% 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶上进行凝胶电泳。然后将蛋白转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用 ColⅠ 和 ColⅢ 一抗和对应的偶联二抗进行免疫印迹显色。

　　1.8 组织学染色

　　培养的血管组织用 PBS 冲洗两次，用 4% 多聚甲醛固定 24 h。然后用酒精进行逐级脱水，再用二甲苯处理后包埋在石蜡中。获得 5 μm 厚的切片用于 Masson 染色，以及 ColⅠ 和 ColⅢ 免疫荧光染色。

　　1.9 数据分析

　　采用 GraphPad Prism 9.0 分析数据及绘制统计图。两组间差异的显著性用非配对 t 检验来确定，多组数据的比较采用双因素方差分析。结果以 “均值 ± 标准差” 表示，P 值小于认为具有显著性差异。显著性水平设定为 P 值 < 0.05(*P 值 < 0.05，**P 值 < 0.01，****P 值 < 0.001，****P 值 < 0.0001>。

　　2 结果

　　2.1 血管平滑肌细胞活性增殖

　　在不同氧气含量下培养 7 d 的 CCK8。除了在第 5 天的 2% 氧气条件下细胞活力低于常氧对照，其他条件下的低氧培养的细胞活力均高于常氧。从细胞活力增长曲线上看，在 7% 氧气条件下的细胞活力增长最快，显示出最强的增殖活力。5% 和 10% 氧气时显示出相近的活力增长。而 2% 氧气条件下的细胞在第 3 天时细胞活力高于其他组，然而在第 5 天时却低于其他组。因此，选用 7% 氧气进行后续实验。

　　2.2 培养基中的总胶原含量

　　不同时间点培养基中所含的羟脯氨酸含量结果。7% 氧气培养的细胞在第 5、7 和 9 天的培养基液中胶原含量显著高于常氧组，而在其他时间点无显著差异。另外，无论是 7% 氧气还是常氧，培养基中的胶原含量在第 9 天时达到峰值。

　　2.3 胶原基因的相对表达

　　qPCR 结果显示与常氧相比，VSMCs 在 7% 氧气条件下 ColⅠ 和 ColⅢ 基因的表达显著上调，分别为 1.20 倍(P=0.0080)和 1.34 倍(P=0.0015)。

　　2.4 分泌到培养基中的 Ⅰ 型胶原蛋白和 Ⅲ 型胶原蛋白的含量

　　对条带进行灰度值分析的结果显示，与常氧条件相比，7% 氧气条件下的培养基中的 ColⅠ 含量在不同时间点均无显著差异。另外，在第 3 和 5 天时两组均无法检测到培养基的 ColⅢ，而在之后的第 7—11 天里 ColⅢ 水平逐渐上升，并且 7% 氧气组培养基的 ColⅢ 水平显著高于常氧组。

　　2.5 细胞层沉积的胶原蛋白含量

　　将培养 11 d 后形成的细胞层刮取下来进行羟脯氨酸含量检测，结果显示，7% 氧气培养下形成的总细胞层中胶原的含量为(2.585±0.042)μg / 孔，显著高于常氧下的含量(0.836±0.024)μg / 孔(P<0.0001)，增加到了 3.1 倍。

　　2.6 PGA 支架上的 TEVG 培养

　　组织切片的 Masson 染色结果显示，常氧条件下的 TEVG 构建体仅在外表面有较多胶原纤维分布，而 7% 氧气处理组管腔内外表面均有较多的胶原纤维分布，并且含有更为丰富的胶原纤维。分别对 ColⅠ 和 ColⅢ 进行免疫荧光染色拍照。结果显示，7% O₂组的中和广泛且密集地分布在组织中，仅有一些由未完全降解的 PGA 纤维丝占据的小空隙存在。这些 PGA 碎片也能在 Masson 染色中观察到。而常氧条件下的构建体内部 ColⅠ 和 ColⅢ 分布相对稀疏，仍有较多空隙未被胶原填充。羟脯氨酸检测结果显示，7% O₂组的中含有的总胶原含量((3.080±0.850)mg/g)显著高于常氧组((1.478±0.124)mg/g)，增加到了 2.09 倍(P=0.0319)。

　　3 讨论

　　本研究观察不同氧气含量对细胞活性的影响结果发现，在 7% 氧气含量下细胞的活性增速最快，反映其对细胞增殖速度的提升。文献 [19-20] 的结果表明，在低氧环境下细胞可以通过 HIF-1α 介导的信号通路上调增殖和代谢相关的基因表达。本研究结果也显示，7% 氧气条件下，血管平滑肌细胞代谢和增殖活性明显提高。虽然不同程度的低氧在早期都促进了细胞活性的增长，但是长时间的过低氧气含量似乎影响了细胞活性的增长。本研究中发现，2% 氧气含量下在第 5 天时细胞活力反而低于常氧对照组。在一些其他人的研究中使用缺氧(1%)条件后细胞活性受到损害 [21-22];这表明一定范围内的低氧含量有利于提高细胞活性，过高或过低可能会起到反作用。基于这些结果，本研究选择了 7% 的氧含量作为后续的低氧实验条件。

　　本研究观察到低氧环境下第 5—9 天细胞培养基中胶原蛋白含量有了显著增加。另外，在第 11 天时培养基中的胶原蛋白含量出现下降。这可能与胶原蛋白在细胞外的组装和交联速率有关，有证据表明胶原蛋白浓度会受胶原交联程度的影响 [23]。

　　从基因的表达来看，低氧环境下 ColⅠ 和 ColⅢ 的 mRNA 水平有所上调，尽管上调的程度不高(约 1.2~1.3 倍)。文献 [24-25] 的结果表明，胶原合成具有复杂的翻译后处理过程，因此 mRNA 水平的变化可能无法完全反映胶原蛋白水平的变化。而从分泌的蛋白来看，常氧和低氧组的培养基中 ColⅠ 蛋白含量没有显著性的差异，尽管在第 3 天时低氧组略高于常氧。此外，在前 5 d 培养基中几乎没有 ColⅢ 蛋白，并且从第 7 天起在低氧组的细胞培养基中 ColⅢ 的增加更为明显，这表明培养基中的胶原蛋白的增加可能主要与 ColⅢ 的释放有关。

　　文献 [17,26-27] 的结果表明，ColⅢ 主要存在于动脉壁的中层中，沉积在 ColⅠ 纤维的外围区域，被认为在调节 ColⅠ 纤维生成中发挥作用。越来越多的研究发现，ColⅠ 主要影响胶原网络的强度，而 ColⅢ 影响胶原网络的弹性。因此，ColⅢ 和 ColⅠ 的比例会影响血管的弹性和适应性重塑能力 [26,28]。此外，在 ColⅠ 和 ColⅢ 的共组装中，当增加 ColⅢ 的比例时，原胶原纤维的成核速率会增加，并且可以调节原胶原纤维的直径 [26,29-30]，因此猜测 VSMCs 响应了低氧而增加 ColⅢ 的分泌可能促进更多的原胶原纤维形成。

　　培养基中的胶原蛋白会进一步组装、交联形成不溶性的胶原纤维，成为细胞外基质的主要组成部分 [24]。本研究发现低氧下胶原分泌的增加确实导致了形成的细胞层 ECM 中胶原蛋白含量的显著增加。利用管状 PGA 支架进行 TEVG 的三维培养，结果发现经过低氧处理 15 d 的 TEVG 胶原生成量增多。与之对应的，是从横截面切片中观察到低氧形成更多的胶原纤维，并且无论在材料表面还是在内部，胶原的分布都更为密集和均匀。这一结果这表明，低氧通过促进胶原的生成和沉积可以加快在三维材料上胶原纤维的形成，产生更多的细胞外基质。以上结果进一步表明，在培养过程使用低氧含量有利于生成更优质的 TEVG，未来具有很好的应用推广前景。

　　4 结语

　　该研究通过营造不同低氧环境处理 VSMCs，发现低氧可以促进 VSMCs 的增殖活性，并且在 7% 氧气条件下活性最高。以 7% 氧气作为最佳条件做进一步的检测发现，低氧上调了胶原基因的表达，并促进胶原蛋白的分泌，尤其是 ColⅢ;低氧还使第 11 天时细胞层 ECM 中总胶原蛋白的含量增加到了 3.1 倍。使用三维支架材料 PGA 接种 VSMCs 培养 TEVG，发现低氧同样增加了 PGA 上沉积的总胶原含量(2.09 倍)，并形成更致密的胶原纤维，从而有利于 TEVG 的构建。这一结果可为选择合适的培养环境条件提供依据，从而为进一步优化 TEVG 的设计和制备提供参考。

林展翼;肖聪;许健宜;刘青;孙盱衡;方丽君,华南理工大学医学院;广东省人民医院;季华实验室,202501