氧化钕暴露引起人胚肺成纤维细胞m6A修饰的改变及其机制

来源：环境与职业医学杂志 2023年第9期北京时间：

作者：赵钊, 郑婧婧, 杨茗琁, 王素华, 史雪敏, 杲淑雯, 赵宇航,

摘要：背景职业和环境颗粒物可引起机体纤维化，并伴随RNA的m6A修饰改变，氧化钕（Nd2O3）可导致小鼠肺部发生纤维化，里面含有大量成纤维细胞。目的探讨Nd2O3引起人胚肺成纤维细胞（HELF细胞）纤维化过程中肿瘤坏死因子受体相关蛋白6/核因子-κB（TRAF6/NF-κB）信号通路的m6A修饰变化，并确定TRAF6的关键m6A修饰位点。方法不同浓度的Nd2O3（0、1.563、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 mg∙L−1）染毒HELF细胞24、48 h，检测细胞活力，确定染毒时间及剂量。检测纤维化指标羟脯氨酸（HYP）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、m6A甲基化水平、甲基化转移酶（METTL3和METTL14）、去甲基化酶（FTO和ALKBH5）、阅读蛋白（YTHDC2和YTHDF2）、纤维化相关基因Ⅰ型胶原蛋白（collagen-Ⅰ）、波形蛋白（vimentin）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、信号通路相关蛋白（TRAF6、NFKB1、P65、P-P65）等蛋白和基因表达情况。采用RNA甲基化免疫共沉淀-实时荧光定量PCR（MeRIP-qPCR）法检测TRAF6 mRNA中m6A的富集情况。结果通过检测细胞活力，确定实验染毒剂量为6.25、12.5、25 mg∙L−1，染毒时间为48 h。暴露48 h后，相较于对照组，25 mg∙L−1 Nd2O3组HYP的含量升高，6.25、12.5、25 mg∙L−1 Nd2O3组TGF-β1的含量均升高（P < 0.05）；HELF细胞12.5、25 mg∙L −1 Nd2O3组总体m6A甲基化的含量升高（P<0.05）；在mRNA水平上，甲基化转移酶METTL3、METTL14（6.25、12.5、25 mg∙L−1 Nd2O3组）的mRNA表达升高（P < 0.05）；阅读蛋白 YTHDF2（6.25、12.5、25 mg∙L−1 Nd2O3组）的mRNA表达升高（P < 0.05），而 YTHDC2（25 mg∙L−1 Nd2O3组）的mRNA表达降低（P < 0.05）；去甲基化酶 FTO（12.5、25 mg∙L−1 Nd2O3组）和ALKBH5（25 mg∙L−1 Nd2O3组）的mRNA表达降低（P < 0.05）；纤维化相关基因 vimentin、α-SMA、collagen-Ⅰ（6.25、12.5、25 mg∙L−1 Nd2O3）的mRNA表达升高（P < 0.05）；通路相关基因 TRAF6（25 mg∙L−1 Nd2O3组）、NFKB1（12.5、25 mg∙L−1 Nd2O3组）的mRNA表达升高（P < 0.05）；在蛋白水平上，相比于对照组，甲基化转移酶METTL3（25 mg∙L −1 Nd2O3组）和METTL14（12.5、25 mg∙L−1 Nd2O3组）升高（P < 0.05）；阅读蛋白YTHDF2（12.5、25 mg∙L −1 Nd2O3组）升高，而YTHDC2（25 mg∙L−1 Nd2O3组）降低（均P<0.05）；去甲基化酶FTO（25 mg∙L−1 Nd2O3组）降低（P<0.05）；纤维化相关蛋白vimentin在Nd2O3浓度为25 mg∙L−1时升高，α-SMA、collagen-Ⅰ的蛋白相对表达量在Nd2O3浓度为12.5、25 mg∙L−1时升高（均P<0.05）；TRAF6和P-P65在Nd2O3浓度为25 mg∙L−1时升高（均P<0.05）。MeRIP-qPCR结果显示，相较于对照组，Nd2O3暴露组的m6A富集比例明显增加（P<0.05）。结论HELF暴露于Nd2O3后，细胞发生纤维化相关指标改变，使得部分m6A甲基化酶表达上升，去甲基化酶表达下降，从而使m6A甲基化上升，并可能通过激活TRAF6/NF-κB信号通路，促进纤维化的进展。

关键词：氧化钕, 纤维化, N⁶-甲基腺苷修饰, 肺成纤维细胞, 肿瘤坏死因子受体相关蛋白6/核因子-κB,