华东理工大学学报·自然科学版杂志投稿格式参考范文：不同单克隆抗体聚集与断裂行为的多维分析

　　1 实验部分

　　1.1 实验原料

　　本研究使用的 ZG154 和 ZG187 抗体属于 IgG1 类，由上海臻格生物技术有限公司提供，样品通过标准色谱过程进行纯化，在 40℃的培养箱中避光放置。实验中所用的氯化钠、二水合磷酸二氢钠等试剂，分别来自国药集团化学试剂有限公司、美国 Sigma-aldrich 公司、普洛麦格生物技术有限公司、美国赛默飞世尔科技公司等，所有试剂均为分析纯，未经纯化直接使用。

　　1.2 实验方法

　　SEC 测定分子大小变异体纯度：采用 Agilent 1260 型液相色谱仪进行分析，对样品的稀释浓度、进样体积、使用的色谱柱、流动相组成、流速、洗脱时间、柱温箱温度以及紫外检测波长等都进行了明确的设定。

　　AUC 测定分子大小变异体纯度：对样品 ZG154 和 ZG187(质量浓度 2mg/mL)进行 SV 分析，包括在 20℃下平衡时间、使用的转子和离心机型号、离心条件、扫描参数以及数据分析所用软件、分布模型、分析置信水平等，同时还设定了不同样品的溶剂密度、黏度以及 SEC 流动相的密度和黏度。

　　蛋白质 PTMs 测定方法：取样品进行一系列处理，包括加入变性缓冲液、DTT，水浴反应后进行烷基化，再脱盐处理，加入 Trypsin 酶反应，最后终止反应上样分析，采用 Q-Exactive 型液质联用仪，对仪器的离子源、质量分析器、色谱柱、流动相以及洗脱模式、分析模式和数据分析软件等进行了详细说明。

　　蛋白质二级与三级结构测定方法：采用 ChirascanTM VX 型圆二色光谱仪在室温下测定样品圆二色性，对样品稀释浓度、比色皿规格、光谱测量范围、步进、采样时间以及结果处理方式都进行了规定。

　　蛋白质熔融温度检测方法：采用 Prometheus NT.Plex DSF 型蛋白稳定性分析仪测定样品熔解温度，对毛细管吸取样品的要求、荧光激发强度调节、起始和终止温度、加热速率以及确定蛋白质熔解温度的方式进行了说明。

　　蛋白质扩散相互作用系数检测方法：将样品稀释到不同浓度，离心后加入 384 孔板，使用 Plate Reader Ⅲ 型高通量动态光散射仪测定扩散系数，规定了测定时的温度、激光功率、测量时间、平行测定次数以及计算扩散相互作用系数的公式。

　　2 结果与讨论

　　2.1 SEC 分析样品聚集与断裂行为

　　40℃时，ZG154 样品中高分子量物质(HMW)随放置时间延长明显增加，聚体和低分子量物质(LMW)含量也逐渐增加，其聚集与断裂行为同时发生;ZG187 样品在 40℃放置一个月后，HMW 含量变化可忽略不计，但 LMW 含量从 0.2% 增加到 2.1%，表明只发生断裂行为。这体现出两种 mAbs 对 40℃环境反应存在差异，后续需 AUC-SV 进一步分析。

　　2.2 AUC-SV 分析样品的聚集与断裂行为

　　相较于 SEC，AUC-SV 更有助于表征样品原生状态。ZG154 样品在 40℃放置时聚体含量明显增加，二聚体沉降系数逐渐降低;ZG187 样品在 40℃下放置一个月后，聚体含量几乎不变，但在 SEC 流动相中测试时，沉降系数分布显著变宽且出现碎片峰，这是因为 SEC 流动相高盐浓度影响了蛋白构象和碎片间非共价相互作用。此外，AUC-SV 测量的聚体含量超过 SEC 法测定结果，是由于 SEC 分析时流动相使样品稀释导致聚体解离。

　　2.3 蛋白翻译后修饰变化

　　蛋白质的 PTMs 变化是导致其聚集和断裂行为的重要因素。40℃放置 1 个月后，ZG154 分子重链 Asn 329 位点脱酰胺修饰比例增加较少，进行 2 个月加速稳定性实验后，该位点脱酰胺修饰比例增加了 30.7%，同时还有其他位点发生脱酰胺或异构化修饰。脱酰胺会引起蛋白质疏水性变化，易引发聚集和断裂。ZG187 样品在 40℃放置一个月后，HC 上 Met 430 位点氧化修饰比例增加了 36.9%，还有少量其他位点氧化修饰，Met 氧化会影响 mAbs 构象稳定性，对聚集与断裂有显著影响。

　　2.4 不同修饰对蛋白二级与三级结构的影响

　　蛋白质二级与三级结构变化可能导致疏水区域暴露，引发聚集。CD 分析表明，40℃条件下放置前后的 ZG154 和 ZG187 样品的 CD 图谱没有明显变化，说明 ZG154 分子 Asn 329 位点的脱酰胺修饰和 ZG187 分子 Met 430 位点发生的氧化修饰没有导致分子二级和三级结构的变化，且二者的 N 糖基化修饰在 40℃放置过程中基本不变，表明其聚集与断裂行为不是由蛋白二级和三级结构变化引起的。

　　2.5 不同修饰对蛋白稳定性的影响

　　Tm 是衡量蛋白质热稳定性的重要指标，脱酰胺和氧化修饰可能破坏蛋白质折叠稳定性。40℃放置后，ZG154 分子各个结构域 Tm 值基本不变，表明其聚集和断裂行为不取决于结构域稳定性变化，而是与琥珀酰亚胺形成有关;ZG187 分子的 Tml 显著下降，说明 Met 430 位点氧化修饰降低了其单个结构域稳定性，导致断裂行为发生。

　　2.6 不同修饰对蛋白分子间相互作用的影响

　　kD 用于描述溶液中溶质分子间相互作用力，蛋白质聚集与分子间相互吸引有关。ZG154 样品的 kD 值为负，说明分子间存在相互吸引作用，40℃放置时聚集行为与之相关，且 Asn 329 位点脱酰胺修饰增加了分子间相互吸引作用，加速聚集并使二聚体沉降系数变小;ZG187 分子的 kD 值为正，且 Met 430 位点氧化修饰后仍为正值，表明分子间总是相互排斥，所以未发生聚集行为。

　　3 结论

　　ZG154 分子 HC 上 Asn 329 位点脱酰胺修饰比例增加 30.7%，加速分子聚集并导致断裂;ZG187 分子 HC 上 Met 430 位点氧化修饰比例增加 36.9%，导致分子单个结构域稳定性下降而发生断裂，但分子间始终相互排斥未发生聚集。该研究为 ZG154 和 ZG187 抗体的进一步分子优化设计和制剂筛选提供了理论依据。

陆治锦;文玺凯;刘鲁杰;王宜冰;沈春雷;伍 维;沈智勇;赵黎明,华东理工大学生物工程学院;上海臻格生物技术有限公司;上海市细胞代谢光遗传学技术前沿科学研究基地,202501