分子对接、CRISPR/Cas9技术筛选并验证DNA ligase IV抑制剂

来源：湖北农业科学杂志2021年第23期北京时间：

作者：肖红卫

单位：动物胚胎工程与分子育种湖北重点实验室/湖北省农业科学院畜牧兽医研究所,武汉 430064

摘要：为了筛选靶向DNA连接酶IV的抑制剂以实现更有效的基因定点插入,采用分子对接技术筛选出与前期研究中靶向DNA连接酶IV的抑制剂SCR7作用类似的小分子化合物。筛选到与化合物库一致的nocodazole、Fisetin和Methylene blue 3个小分子化合物,通过用MSTN基因T11位点序列截断的Firefly Luciferase荧光素酶报告载体结合CRISPR/Cas9-gRNA-T11载体共转细胞,并结合不同的小分子化合物处理。结果表明,没有用小分子化合物处理时,萤火虫荧光素酶被截断的位置发生NHEJ修复,不能得到大量有活性的萤火虫荧光素酶;经过小分子化合物处理,抑制了细胞内的NHEJ,提高了HDR效率,能得到大量有活性的萤火虫荧光素酶。使用nocodazole、Methylene blue和Fisetin处理后的萤火虫荧光素酶检测结果65 256.3、53 713和77 058.3分别是SCR7处理后的萤火虫荧光素酶检测结果41 905.3的1.6、1.3和1.8倍,是没有SCR7处理后的萤火虫荧光素酶检测结果10 120的6.4、5.3和7.6倍。证明所用的筛选策略正确,所筛选出的小分子化合物是具有DNA ligase IV抑制活性的抑制剂,为后续研究奠定了基础。

关键词：DNA连接酶IV,抑制剂,荧火虫荧光素酶报告载体,CRISPR/Cas9,小分子化合物

基金资助：湖北省农业科技创新中心项目（2019-620-000-001-20）; 湖北省农业科学院青年拔尖人才项目（Q2018020）; 湖北省农业科学院领军人才项目（L2018015）; 国家自然科学基金项目（31772577）; 湖南创新型省份建设专项（2019RS1068）; 重点领域研发计划（2020WK2030）; 重点实验室开放课题（KLAEMB-2020-01）; 外国青年人才计划项目（QN20200127002）; 中国科学院战略性先导科技专项（XDA24030204）