瘤胃脂肪分解菌实时荧光定量PCR方法的构建

来源：华北农学报杂志2015年第1期北京时间：

作者：范文斌, 刘永斌, 李长青

单位：1. 呼和浩特职业学院 生物化学工程学院, 内蒙古 呼和浩特 010051;；2. 内蒙古农牧业科学院, 内蒙古 呼和浩特 010031

摘要：为定量测定瘤胃脂肪分解菌,试验构建了脂肪分解菌实时荧光定量PCR的标准品及标准曲线。提取瘤胃微生物总DNA,以脂肪分解菌16S rDNA特异性引物进行PCR扩增,回收PCR产物,与 PMD19-T Vector 连接并转化大肠杆菌。阳性重组质粒经PCR和测序鉴定后,将提取的质粒DNA进行梯度稀释并作为模板,利用荧光定量PCR反应做出标准曲线。结果显示:PCR产物与目的基因的相似性大于99%,以不同稀释度的重组质粒为模板获得的荧光定量PCR扩增曲线差异明显,构建了相关系数接近1的标准曲线,且熔解曲线峰值单一。试验建立的实时荧光定量PCR方法可用于瘤胃脂肪分解菌的定量检测,为进一步研究该菌在反刍动物瘤胃发酵中的分子机理奠定了基础。

关键词：瘤胃脂肪分解菌,实时荧光定量PCR,标准品质粒,标准曲线,

基金资助：内蒙古自然科学基金项目(2012MS0417);国家自然科学基金项目(31460615)