抗凋亡融合蛋白PTD-Bcl-xL原核表达载体的构建及表达纯化

来源：华北农学报杂志2016年第1期北京时间：

作者：王晓晔, 石博妹, 王英群, 李珣, 刘徳玉, 李铭, 李芳芳, 胡传活

单位：1. 广西大学动物科学技术学院, 广西南宁 530005;；2. 广西畜禽品种改良站, 广西南宁 530001

摘要：人工抗凋亡蛋白PTD-Bcl-xL能保护多种因素引起的细胞异常凋亡,为了获得高纯度Bcl-xL与PTD(Protein transduction domains)的融合蛋白,首先采用TRIzol法提取SD大鼠肝脏总RNA,将RNA反转录为cDNA,设计引物以cDNA为模板,PCR扩增Bcl-xL基因,构建pUM19-T-Bcl-xL质粒,并对质粒双酶切鉴定和测序鉴定;其次设计包含PTD序列的Bcl-xL引物,以测序正确的pUM19-T-Bcl-xL质粒为模板,PCR扩增PTD-Bcl-xL序列,将扩增序列克隆入pET28a载体,构建PTD-Bcl-xL蛋白的原核表达质粒pET28a-PTD-Bcl-xL,并对pET28a-PTD-Bcl-xL载体双酶切鉴定和测序鉴定;将pET28a-PTD-Bcl-xL重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,并对IPTG诱导融合蛋白表达的浓度和诱导时间进行了优化;SDS-PAGE分析表达蛋白的可溶性情况,在变性条件下用Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白;最后用SDS-PAGE、Western Blot及质谱对融合蛋白进行鉴定。结果表明:双酶切pUM19-T-Bcl-xL质粒出现约774 bp大小条带,pUM19-T-Bcl-xL质粒测序结果与NCBI数据库比对序列一致,表明成功构建pUM19-T-Bcl-xL质粒;双酶切pET28a-PTD-Bcl-xL质粒出现约744 bp大小条带,pET28a-PTD-Bcl-xL质粒测序结果与预期序列一致,表明成功构建了pET28a-PTD-Bcl-xL原核表达载体;在IPTG诱导下pET28a-Bcl-xL重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出36 kDa大小蛋白,最优IPTG诱导浓度为0.1 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为6 h;SDS-PAGE电泳显示融合蛋白主要出现在菌液超声后的沉淀里,以包涵体形式表达,经Ni-NTA琼脂纯化获得了高纯度的融合蛋白;Western Blot和质谱鉴定证明IPTG诱导表达蛋白和纯化的融合蛋白为PTD-Bcl-xL蛋白。纯化得到了PTD-BcL-xL融合蛋白,推进了PTD-Bcl-xL蛋白在猪、牛等家畜精液冷冻保存的应用进程。

关键词：Bcl-xL蛋白,PTD,原核表达,蛋白纯化,

基金资助：广西科学研究与技术开发计划项目(桂科能1598022-2);广西畜禽品种改良站横向科技项目(20140220)