苹果抗ASPV病毒RNAi载体构建及转化砧木M26的研究

来源：华北农学报杂志2016年第4期北京时间：

作者：田莉莉, 牛良

单位：中国农业科学院 郑州果树研究所, 河南 郑州 450009

摘要：为获得抗病毒的转基因植物新材料，采用同源重组法构建了抗苹果茎痘病毒的植物表达载体，并对苹果砧木材料M26进行了遗传转化，成功获得了转基因阳性植株。首先以感病的皇家嘎拉叶片为材料，反转录合成cDNA第一链，采用PCR方法克隆获得了489 bp的ASPV外壳蛋白基因的保守片段，通过TOPO克隆技术将该基因片段连接进入载体pENTR/SD/D，构建了入门克隆载体pEN-ASPV，再通过LR反应置换该片段连接进入目标载体pHellsgate12，构建了RNAi植物表达载体Phe-ASPV，并采用冻融法转入根癌农杆菌菌株EHA105中，获得了可用于植物遗传转化的工程菌EH-ASPV。采用农杆菌介导的方法转化苹果砧木M26叶盘，经抗生素筛选和脱菌培养获得了Kan抗性芽，进一步进行生根培养后获得了完整的Kan抗性植株，对生根植株提取总RNA后RT-PCR检测结果显示，RNAi表达载体上携带的外源基因片段（489 bp）已成功转入苹果砧木材料M26中，并在转基因植株内RNA水平上得到表达。获得的转基因新材料，为进一步通过病毒接种进行抗病性评价及抗病毒分子育种奠定了基础。

关键词：苹果茎痘病毒,<em>CP</em>基因,RNAi载体,遗传转化,

基金资助：国家“863”项目（2011AA100204）