肝片吸虫Fh8明显增强STEC的Stx1可溶性表达及Stx1单克隆抗体制备

来源：华北农学报杂志2016年第5期北京时间：

作者：张雪寒, 张碧成, 张强, 汪伟, 何孔旺

单位：江苏省农业科学院 兽医研究所, 农业部兽用生物制品工程技术重点实验室, 国家兽用生物制品工程技术研究中心, 江苏 南京 210014

摘要：志贺毒素1（Shiga toxin 1，Stx1），系五聚体蛋白，是产志贺毒素性大肠杆菌（Shiga Toxin-producing Escherichia coli，STEC）主要的毒素因子，但Stx1体外极不易可溶性表达，旨在克隆和表达志贺毒素1（Shiga toxin 1，Stx1）A亚基，体外获得可溶性表达的Stx1，以研制单克隆抗体。生物信息学软件分析Stx1A亚基氨基酸序列，Stx1A1亚基N端为信号肽段，其C端高疏水性和低免疫原性。PCR扩增stx1A亚基73~759的687个核苷酸，与肝片吸虫Fh8基因串联，克隆到低温表达载体pCold Ⅰ以构建重组菌，诱导表达重组毒素His-Fh8-Stx1A，SDS-PAGE分析蛋白表达形式。重组毒素His-Fh8-Stx1A免疫Balb/c小鼠，Sp2/0细胞融合筛选、制备阳性杂交瘤和单克隆抗体。PCR扩增Fh8和stx1a亚基并构建重组质粒pCold Ⅰ-His-Fh8-stx1，重组蛋白在原核细胞中得到高效表达，且以可溶性形式存在于菌体胞浆中。以重组His-Fh8-Stx1A为免疫原，成功制备3株能稳定传代并分泌Stx1的单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞株，取其中1株成功制备高ELISA效价的腹水。Western Blot显示，纯化的单克隆抗体可与重组免疫原His-Stx1A和天然志贺毒素1发生特异性反应。本试验成功可溶性表达志贺毒素1A亚基，并获得多株单克隆抗体，为研制用于检测STEC的夹心ELISA和胶体金试纸条奠定理论基础。

关键词：产志贺毒素大肠杆菌,志贺毒素1,肝片吸虫,Fh8,可溶性表达,单克隆抗体,

基金资助：国家自然科学基金项目（31572503）；江苏省自主创新资金项目（CX（15）1060）