同步检测PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3的三重RT-qPCR方法的初步建立

来源：华北农学报杂志2017年第2期北京时间：

作者：胡加谊, 罗志文, 何凡, 李向宏, 胡福初, 范鸿雁, 刘志昕, 张治礼

单位：1. 海南省农业科学院 热带果树研究所, 农业部海口热带果树科学观测实验站, 海南省热带果树生物学重点实验室, 海南 海口 571100;；2. 黄埔出入境检验检疫局, 广东 广州 510730;；3. 中国热带农业科学院 热带生物技术研究所, 海南 海口 571101

摘要：目前我国菠萝产区已相继报道3种菠萝凋萎相关病毒（PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3）。通过建立这3种菠萝凋萎相关病毒实时荧光定量RT-PCR（RT-qPCR）同步定量检测方法，为菠萝凋萎病毒的定性定量研究提供技术手段。根据这3种菠萝凋萎相关病毒的外壳蛋白基因序列分别设计特异性引物和TaqMan水解探针，在优化PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-qPCR反应体系后，以PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3 CP基因目的片段的重组质粒为标准品绘制标准曲线，初步建立了PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-qPCR检测方法。其中PMWaV-1标准曲线为y=-3.283logx+39.02，其扩增效率达101.7%，线性相关系数R2=0.999；PMWaV-2标准曲线为y=-3.393 logx+37.53，其扩增效率为97.1%，线性相关系数R2=0.998；PMWaV-3标准曲线为y=-3.171 logx+38.48，其扩增效率为106.7%，线性相关系数R2=0.996；这表明3种菠萝凋萎相关病毒质粒标准品在同一反应体系中可稳定扩增，且线性关系表现良好，可用于后续试验。灵敏度试验数据表明，该方法对PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3的最低检测线分别为99，98，868拷贝；重复性试验表明PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3三重RT-qPCR扩增曲线的标准差小于0.267，变异系数小于1.44%。这表明建立的三重RT-qPCR检测方法可快速、准确、稳定地定量检测PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3等3种病毒，为PMWaV的定性定量研究和复合侵染机制的探索提供了技术基础。

关键词：菠萝凋萎病,检测方法,实时荧光定量RT-PCR,PMWaV,TaqMan探针,

基金资助：海南省重点研发项目（ZDYF2016035）；公益性行业（农业）科研专项经费项目（201203021）；国家自然科学基金项目（31260460）