黄瓜S期激酶相关蛋白Skp1的原核表达及其多克隆抗体的制备

来源：华北农学报杂志2017年第6期北京时间：

作者：孙新艳, 魏莹, 韩晓玉, 王振跃, 陈琳琳, 燕照玲, 施艳

单位：1. 河南省果树瓜类生物学重点实验室, 河南 郑州 450002;；2. 河南农业大学 植物保护学院, 河南 郑州 450002;；3. 河南省农业科学院, 河南 郑州 450002

摘要：S期激酶相关蛋白1（Skp1）是SCF型E3泛素连接酶途径的核心蛋白，在真核生物的细胞周期、转录调控、信号传导等细胞进程中发挥关键作用。为了深入研究Skp1的基因功能，通过反转录PCR扩增黄瓜Skp1基因的全长阅读框，Skp1基因全长阅读框由468个核苷酸组成，共编码155个氨基酸，将其通过酶切连接的方式克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中，获得重组载体pET Skp1，PCR验证及克隆测序确定开放阅读框的正确性。将重组质粒pET Skp1转化大肠杆菌BL21菌株，通过IPTG诱导表达，SDS-PAGE分析表明，在37℃条件下，经IPTG（1 mmol/L）分别诱导3，6，9 h，Skp1基因在大肠杆菌BL21中均得到高效表达，6，9 h对表达量的影响不明显，因此，可用3 h作为后期诱导表达蛋白的时间。将纯化的蛋白作为抗原，免疫新西兰大耳白兔，采集第5次后血清用ELISA测定效价范围为1：128 000~512 000。提取黄瓜叶片的总蛋白，利用获得的抗血清进一步通过Western Blot检测特异性，结果表明，抗血清在500倍和1 000倍稀释时均能特异性地检测到黄瓜叶片中的Skp1蛋白，条带大小在20 kDa左右，与预期的Skp1蛋白大小一致。

关键词：黄瓜,S期激酶相关蛋白1,原核表达,抗血清,

基金资助：河南省果树瓜类生物学重点实验室开放课题（HNS-201508-9）；河南省科技攻关项目（162102110102）