分析科学学报杂志投稿格式参考范文：诺氟沙星分子印迹电化学传感器的制备及应用

　　引言

　　诺氟沙星 (NFX) 属于氟喹诺酮类药物，常用作预防和治疗动物的炎症，如呼吸道和皮肤感染 [1]｡由于 NFX 过度使用，在环境中可检测到大量的 NFX 残留 [2], 环境中残留的 NFX 又会通过生物链对人体构成潜在危害，如引发肾脏疾病､过敏反应､生殖疾病等 [3]｡因此，为了保护环境安全和人类的健康，需要开发一种高效快捷的方法实现对 NFX 的检测｡目前已报道了多种 NFX 的检测方法，如荧光法 [4]､毛细管电泳 [5] 和化学发光 [6] 等｡这些方法虽然灵敏度高且准确性好，但存在样品前处理复杂､或操作复杂耗时､或需要贵重的仪器等问题｡而电化学分析方法具有灵敏度高､设备简单､易于自动化等优势，在药物活性成分检测中扮演重要角色 [7]

　　碳纳米纤维 (CNFs) 具备优良的导电性､大的比表面积和良好的化学稳定性，已应用到电化学传感器领域 [8]｡静电纺丝是一种常规制备 CNFs 的方法之一｡有机聚合物通常是电纺 CNFs 的前驱体，所获得的 CNFs 可以最大程度的暴露出活性位点，并且可以将电活性材料固定在表面和内部 [9]｡同时 CNFs 的网络结构能更好的适应电化学循环过程中变化 [10]｡壳聚糖 (CS) 是一种天然多糖，价格低廉，具有良好的粘附性和成膜性 [11], 广泛应用在医学､制药和生物技术等领域｡据报道，CS 可与碳基材料､金属纳米材料和离子液体等导电材料结合形成导电膜 [12], 在电极修饰方面具有较大的应用潜力｡分子印迹聚合物 (MIP) 不仅可识别待测分子的官能团种类 [13], 还能识别其形状和大小 [14]｡因此，MIP 对待测分子具有高度的选择性，引入 MIP 是提高电化学传感器选择性的重要策略之一 [15]｡

　　本论文以聚丙烯腈 (PAN) 为碳源，将静电纺丝和碳化法制备的 CNFs 分散在 CS 溶液中｡利用滴涂法将其修饰在玻碳电极(GCE)上，获得 CNFs-CS/GCE。然后以诺氟沙星(NFX)为模板分子、邻苯二胺(o-PD)为单体，通过循环伏安法 (CV) 在 CNFs-CS/GCE 上电聚合生成 NFX 模板分子的印迹聚合物，洗脱 NFX 后得到对 NFX 具有特异性识别的传感器。使用 [Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻作为探针，利用差示脉冲伏安法 (DPV) 对 MIP/CNFs-CS/GCE 进行性能测定，结果显示，该传感器具有制备简单､灵敏､快速和选择性高等优点，可成功用于牛奶中 NFX 的检测｡

　　1 实验部分

　　1.1 仪器与试剂

　　FEINovaNano 型超高分辨场发射扫描电子显微镜 (美国 FEI 公司);Thermoescalab250Xi 型光谱仪 (上海非利加实业公司);BrukerD8 型 X - 射线衍射分析仪 (长沙艾克赛仪器设备公司);Cary660 型红外光谱仪 (安捷伦科技公司);RST5200-0 型电化学工作站 (郑州世瑞思仪器科技公司)｡

　　诺氟沙星 (NFX, 上海阿拉丁公司);0.01mol/L 的 NFX 标准溶液：称量 31.93mgNFX 溶于 3mL 0.1mol/L 的 HCl 中，并用超纯水定容至 10mL｡聚丙烯腈 (PAN)､邻苯二胺 (o-PD)(上海麦克林有限公司); 壳聚糖 (CS)(国药集团化学试剂公司); 磷酸二氢钾 (广东光华科技公司); 磷酸氢二钾､亚铁氰化钾､甲醇和乙酸 (西陇化工试剂公司); 铁氰化钾､N,N - 二甲基甲酰胺 (成都科隆化学品公司); 所有试剂均为分析纯，所有实验用水均为超纯水｡

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 CNFs 的制备

　　将 1gPAN 搅拌分散于 9gDMF 溶液中，随后在 60℃下加热搅拌直至 PAN 完全溶解｡将溶液超声 40min 后在常温下搅拌 12h, 得到均匀纺丝液｡将纺丝液装入 10mL 注射器中，静电纺丝参数设置为：电压 18kV; 针尖与接收器之间为 10cm; 流速为 2mL/h; 收集器转速为 150r/min｡纺丝结束后将收集到的 PAN 纤维在 70℃下干燥 12h｡将干燥后的 PAN 纤维放入马弗炉中，以 5℃/min 的升温速率升温至 250℃, 并在 250℃下保温 2h, 待冷却至室温得到预氧化纤维｡将预氧化后的纤维置于管式炉中在 N₂气流中以一定的升温速度从室温升温至 800℃，并在 800℃条件下保温 2h，高温碳化结束后即可得到 CNFs 材料｡

　　1.2.2 MIP/CNFs-CS/GCE 的制备

　　将 GCE 用 0.30μm 和 0.05μm Al₂O₃粉浆抛光至表面光滑，并在乙醇和超纯水中进行超声清洗，然后用 N₂气流吹干备用。将 CNFs 加入 CS 溶液中 (0.02g CS 溶于 1.0mL 乙酸，超纯水定容至 10mL)，超声 30min 得到均匀的 CNFs-CS 悬浮液｡使用移液枪取 5μL 滴到 GCE 电极表面，白炽灯下干燥 30min, 得到 CNFs-CS/GCE｡

　　将 CNFs-CS/GCE 放入含 NFX 和 o-PD 的磷酸盐缓冲溶液 (pH=5.0，浓度为 0.1mol/L) 中，采用循环伏安法 (CV), 在 - 0.1~1.2V 范围循环扫描 10 圈，扫描速率为 100mV/s, 得到 MIP/CNFs-CS/GCE｡自然晾干后，放入甲醇 - 乙酸 (体积比 9∶1) 洗脱液中浸泡 15min, 得到有 NFX 分子印迹孔穴的 MIP/CNFs-CS/GCE。聚合过程中不加入 NFX, 其他步骤相同，制备非分子印迹电极 NIP/CNFs-CS/GCE｡

　　1.2.3 电化学检测

　　电化学行为测试在含 [Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻的溶液中进行，CV 的扫描范围为 - 0.3~0.8V, 速率为 100mV/s,EIS 交变电压为 7mV, 频率范围为 1Hz~139000Hz｡测试时，先将 MIP/CNFs-CS/GCE 放入含有 NFX 的 10mL PBS (0.1mol/L) 中吸附一定时间，取出并用水冲洗后，再放入含 [Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻的溶液中，用 DPV 法对探针进行电化学测试，DPV 范围为 - 0.1V~0.45V, 振幅为 0.05V｡

　　2 结果与讨论

　　2.1 CNFs 材料的表征

　　对 PAN 纤维､预氧化后纤维和 CNFs 的形貌分别进行 SEM 表征。PAN 纤维缺乏取向性，呈现无规则排列，并且纤维相互交叉形成网状结构｡纤维直径范围在 200~550nm 之间，平均直径约为 343nm｡预氧化后纤维出现了弯曲收缩状态，纤维直径减小，平均直径约为 325nm｡CNFs 继承了 PAN 纤维的无序性和网状结构，其纤维直径进一步减小，主要是因为在碳化过程中纤维的许多成分以气体形式排出，如 H₂O、N₂和 HCN。

　　红外光谱表征结果显示，PAN 纤维在 1455cm⁻¹ 和 2942cm⁻¹ 处的吸收峰分别对应 - CH₂基团的弯曲振动和伸缩振动，在 2244cm⁻¹ 处的吸收峰对应 - CN 基团 [16]。预氧化后纤维在 810cm⁻¹ 和 3460cm⁻¹ 处出现了新的吸收峰，在 810cm⁻¹ 处的吸收峰是由于预氧化过程中有芳环结构的形成，发生了环化反应;3460cm⁻¹ 处的吸收峰对应 - OH 基团，因为预氧化过程中发生了脱氢和氧化反应｡而 CNFs 的 FT-IR 光谱中无任何明显的结构吸收峰，因为黑碳纳米纤维具有高吸光度 [17]。

　　对 PAN 纤维和 CNFs 进行了 X 射线衍射 (XRD) 表征，PAN 纤维在 17° 和 28.8° 出现衍射峰，分别对应 PAN 的 (200) 和 (110) 晶面 [18,19]｡高温碳化后，PAN 的衍射峰消失，在 24° 和 44° 出现衍射峰，分别对应 (002) 和 (101) 型石墨晶面，证明 CNFs 呈现优异的石墨化晶体结构 [20]。

　　对 CNFs 进行 X 射线光电子能谱 (XPS) 表征，从 XPS 全谱中可以看出 CNFs 材料中出现了 C、N 和 O 的信号峰。C1s 的高分辨 XPS 谱被分解出 3 个典型的峰，分别对应 C-C (284.72eV)、C-N (285.74eV) 和 C=O (289.19eV) 键 [21,22]。N1s 的高分辨谱被拟合出 3 个单峰，分别对应吡啶氧化 N (403.72eV)、吡咯 N (400.48eV) 和吡啶 N (398.29eV)[23]｡此外，在拟合的 O1s 光谱中，在 532.07eV 和 530.83eV 处的 2 个峰被认为是 C-O 和 C=O 键 [24,25]｡

　　2.2 MIP/CNFs-CS/GCE 的电化学表征

　　采用 CV 对不同修饰电极进行电化学表征，[Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻在 GCE 上出现一对氧化还原峰 (曲线 a)｡在 CNFs-CS/GCE 上，由于 CNFs-CS 具有较大的比表面积，可与探针溶液产生静电作用，有助于吸附富集，因此可观察到 [Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻的氧化还原峰明显增大 (曲线 b)。在 CNFs-CS/GCE 表面聚合 MIP 膜后，MIP 膜会阻碍电子的转移，使氧化还原峰变小 (曲线 c)｡由于 MIP 膜上的 NFX 经洗脱后会留下印迹孔穴，为 [Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻提供了电子转移通道，使氧化还原峰明显增大 (曲线 d)｡经重新吸附 NFX 后，膜的印迹孔数量减少，使 MIP/CNFs-CS/GCE 氧化还原峰减小 (曲线 e)｡由于 NIP 不存在印迹孔穴，因此，洗脱前后的氧化还原峰 (曲线 f、曲线 g) 无明显变化｡结果表明，MIP 电化学传感器对 NFX 具有良好的选择性｡

　　采用 EIS 表征不同修饰电极的阻抗变化，GCE 的阻抗很小 (曲线 a)｡CNFs-CS/GCE 比 GCE 的半圆直径有所减小，说明阻抗变小 (曲线 b)｡MIP/CNFs-CS/GCE 阻抗变大，这是因电极表面有致密的聚合膜阻碍了探针进入电极表面 (曲线 c)｡当模板分子 NFX 洗脱后，印迹膜上存在 NFX 印迹孔穴，[Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻探针可通过孔穴到达电极表面，阻抗图中半圆直径减小，阻抗减小 (曲线 d)。由于 NIP 不存在印迹孔穴，[Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻不能有效扩散到电极表面，所以 NIP/CNFs-CS/GCE 电极洗脱前后的阻抗图中半圆直径无明显变化 (曲线 e、曲线 f)。

　　在 [Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻溶液中用 CV 法考察扫描速率 v 对氧化还原峰电流的影响，当 v 从 20mV/s 增大到 180mV/s 时，[Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻的氧化峰电流 (Iₚₐ) 和还原峰电流 (Iₚc) 也同步增加。Iₚₐ和 Iₚc 分别与 v 之间呈良好的线性关系，线性方程分别为 Iₚₐ(μA)=0.144v + 36.682(R²=0.98)和 Iₚc (μA)=-0.477v - 51.302(R²=0.99)，表明 [Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻在 MIP/CNFs-CS/GCE 上的电极反应过程受吸附控制｡

　　2.3 实验条件优化

　　2.3.1 CNFs-CS、o-PD 及 NFX 浓度的优化

　　条件优化采用 [Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻的绝对峰电流进行判断，考察了修饰层(CNFs-CS)浓度、单体(o-PD)浓度和模板分子(NFX)浓度对电极峰电流的影响。结果显示，峰电流随 CNFs-CS 浓度的增大呈现先增加后减小的趋势，在浓度为 1.5mg/mL 时达到最大｡因此，选择 CNFs-CS 的最佳滴涂浓度为 1.5mg/mL｡合适的单体和模板分子浓度有利于形成最多的分子印迹位点，且构型稳定，有利于电子的转移。实验发现，峰电流随 o-PD 浓度和 NFX 浓度的增大呈现先增加后减小的趋势，在 o-PD 浓度为 2.0mg/mL 和 NFX 浓度为 90μmol/L 时达到最大，因此选择 o-PD 和 NFX 的最佳浓度分别为 2.0mg/mL 和 90μmol/L｡

　　2.3.2 聚合圈数、洗脱时间和重吸附条件的优化

　　实验考察了电极聚合圈数、洗脱时间和重吸附时间对峰电流的影响｡结果显示，峰电流随聚合圈数的增多呈现先增加后减小的趋势，达到 10 圈时最大｡因此，选择 MIP 最佳聚合圈数为 10｡随着洗脱时间的增加，印迹孔穴数量增多，峰电流增大;当洗脱 15min 后，峰电流保持平稳，所以选择洗脱时间为 15min｡在 0~15min 内，随着重吸附时间增加，峰电流减小;当重吸附超过 15min 后，峰电流达到最小值并保持平稳，表明 MIP 对 NFX 已吸附平衡｡因此，选择重吸附时间为 15min｡

　　2.3.3 富集电位和富集时间的优化

　　考察了 [Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻探针富集电位和富集时间对峰电流的影响，结果显示，富集电位在 - 0.1V 时峰电流达到最大值｡当富集时间超过 60s 时，峰电流达到最大值并趋于平稳，表明电极对 [Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻探针已吸附饱和，因此选择最佳富集电位和富集时间分别为 - 0.1V 和 60s｡

　　2.3.4 pH 值对电极电化学性能的影响

　　溶液 pH 值对峰电流的影响显著，当溶液 pH 值从 4.0 增加至 5.0 时，峰电流逐渐增大;在 pH=5.0 时达到最大值;当溶液 pH 值超过 5.0 时，峰电流开始逐渐减小。因此，选择最佳的溶液 pH 为 5.0｡

　　2.4 MIP/CNFs-CS/GCE 的分析性能

　　在最佳实验条件下，将 MIP/CNFs-CS/GCE 与NIP/CNFs-CS/GCE 置于不同浓度的 NFX 溶液中进行吸附后，使用 DPV 法对 [Fe (CN)₆]³⁻/⁴⁻探针进行测试。随着 NFX 浓度的增大，峰电流逐渐减小，表明电极对 NFX 的吸附量不断增加。吸附前后的峰电流变化值 ΔI 与 NFX 浓度在 0.05~30μmol/L 范围内呈良好线性关系，其线性方程为 ΔI=1.766c (μmol/L)+3.7236，相关系数 R²=0.992。MIP/CNFs-CS/GCE 检测 NFX 的 LOD(检测限)为 16nmol/L(S/N=3)。与 NIP/CNFs-CS/GCE 相比，MIP/CNFs-CS/GCE 检测 NFX 具有较高的灵敏度。

　　与文献报道的 NFX 电化学传感器相比，MIP/CNFs-CS/GCE 具有较宽的线性范围和更低的检出限，显示出优异的综合性能。

　　2.5 重现性和选择性

　　在相同条件下制备 7 根 MIP/CNFs-CS/GCE，对浓度为 10μmol/L NFX 的峰电流变化进行检测。7 支电极检测 NFX 峰电流的相对标准偏差(RSD)为 3.89%，表明所制备电极具有良好的重现性。

　　选择与 NFX 具有相似结构的氯霉素(CAP)、盐酸环丙沙星(CPX)、氧氟沙星(OFLX)和四环素(TC)作干扰物。分别将 MIP/CNFs-CS/GCE 与 NIP/CNFs-CS/GCE 置于上述干扰物溶液(20μmol/L)中进行吸附后，用 DPV 法检测。结果显示，MIP/CNFs-CS/GCE 对 NFX 的响应大于其他干扰物质，而 NIP/CNFs-CS/GCE 对所有物质的响应均无明显变化，说明 MIP/CNFs-CS/GCE 具有良好的选择性。

　　2.6 实际样品的检测

　　为了考察 MIP/CNFs-CS/GCE 对实际样品的检测效果，对市售的牛奶进行 NFX 检测。将牛奶样品进行离心，取上清液后，采用本方法进行检测，结果显示本法检测的牛奶中未含 NFX。

　　在牛奶中分别加入 0.5μmol/L、5μmol/L、15μmol/L 的 NFX 溶液，进行加标回收实验。加标回收率在 92.03%~99.33% 之间，RSD 在 1.89%~3.66% 之间，表明 MIP/CNFs-CS/GCE 可应用于牛奶中 NFX 的检测。

　　3 结论

　　本文以 PAN 为碳源，通过静电纺丝和碳化法制备出 CNFs，基于其导电性和 CS 的成膜性，制备了玻碳修饰电极(CNFs-CS/GCE)。以邻苯二胺(o-PD)为功能单体、诺氟沙星(NFX)为模板分子，采用电聚合法在 CNFs-CS/GCE 上成功制备出 MIP 膜，获得 MIP/CNFs-CS/GCE。

　　其中，经过静电纺丝和高温碳化法制备的 CNFs，导电性好、比表面积大、稳定性高;以电化学聚合法制备的 MIP 具有简单、快速、条件温和等优点。所建立的检测方法可应用于牛奶中 NFX 的检测，为实际样品中诺氟沙星的高效、准确检测提供了可靠的技术手段。

郭航雨;李利军;冯 旭;覃丹凤,广西科技大学生物与化学工程学院;广西糖资源绿色加工重点实验室;蔗糖产业省部共建协同创新中心;广西科技大学医学部,202406