病毒学报杂志投稿格式参考范文：病毒感染性检测方法研究进展

　　引言

　　食品及食品包装容器的病毒污染是导致急性、亚急性等食源性疾病的主要原因之一，也是全球食品安全的一个重要防控内容。目前已知能感染人类的病毒分为 24 个家族，而至少一半可通过食物传播。札幌病毒、冠状病毒、轮状病毒、诺如病毒、肠病毒等是常见的食源性病毒，其中，甲型肝炎、诺如病毒和轮状病毒污染最为广泛。据报道，严重急性呼吸综合征冠状病毒 2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)可能通过食品流通途径传播，使得食品生产、分配、加工、贸易等过程监管和消费者健康面临巨大挑战。近年来，新鲜农产品、贝类及其它即食或预制食品被认为是与病毒暴发密切相关的食物种类。此外，研究表明意大利的大多数甲型肝炎病毒和诺如病毒中毒与食用生的或未煮熟的贻贝、牡蛎有关。因此，快速、精准的病毒载量和感染能力检测对食源性病毒的防控和风险评估具有重要意义。但目前病毒感染性分析仍以传统的检测方法为主，耗时、通量低等局限难以满足食品、环境等病毒采样后的快检要求。

　　目前病毒的定量方法有免疫测定法、定量 PCR(Quantitative polymerase chain reaction, qPCR)、免疫荧光病灶测定、流式细胞术和下一代测序(Next generation sequencing, NGS)等。在方法开发上，主要为针对病毒核酸载量的检测。尽管这些技术具有高灵敏度和特异性的特点，但难以对感染性病毒进行准确定量和提供关于病毒繁殖或感染能力的信息，不能区分感染性、非感染性病毒颗粒。病毒的感染能力对分析病毒颗粒结构、病毒发病机制以及抗病毒药物研发与评估、疫苗开发等至关重要。常用的病毒感染力检测方法主要有空斑形成单位法(Plaque-forming unit, PFU)、病灶形成单位测定法(Focus forming unit, FFU)、50% 组织培养感染剂量(TCID₅₀)法，其次是免疫学方法。PFU 法是分析感染性病毒滴度的金标准。但传统的 PFU、FFU 和 TCID 法耗时费力，结果易受影响，重复性和准确度不高。为了克服传统病毒滴度测定方法的局限，逐渐开发了一系列利用光学、流体力、传感等技术对已有方法进行改进或构建新的具有优异性能的活病毒量化方法。因此，本文主要对目前报道的病毒滴度分析方法的构建原理、应用以及性能等进行综述，并对病毒感染能力分析方法发展进行了展望，以期为食源性病毒的有效监管提供思路依据。

　　1 病毒滴度分析用细胞系的选择

　　病毒感染力的检测主要采用体外细胞培养法。细胞系的选择很大程度影响方法的性能和结果的准确性(常用的细胞系见表 1)。不同类型的病毒对同一细胞系的敏感性可能不同，相应的细胞病变效应(Cytopathic effect, CPE)也存在差异。非洲绿猴肾(Vero)细胞是 PFU 和终点稀释法测定应用最广泛的细胞系。Vero 细胞对 SARS 病毒和 MERS 冠状病毒敏感，易形成斑块进行分析，但对人类冠状病毒(Human coronavirus, HCoV)229E 和 OC43 病毒不敏感。Bracci 等优化了以琼脂糖为涂层的 PFU 滴定法，发现水貂肺上皮细胞(Mink lung epithelial cells, Mv1Lu)可用于 HCoV 229E 和 OC43 病毒活力的滴定，其滴度与人肺成纤维细胞(MRC-5)、人横纹肌肉瘤(Human rhabdomyosarcoma, RD)细胞系获得的滴度基本一致。但恒河猴肾上皮细胞(LLC-MK2)对两种病毒不敏感，难以形成空斑。此外，人类冠状病毒 NL63 在 Mv1Lu、RD、LLC-MK2 和 Vero 细胞中可增殖，但 CPE 并不显著，不适用于 PFU 法的滴定。MRC-5 细胞对培养环境敏感且生长缓慢，对于短时间内形成单层细胞的效果并不理想。基于 B 细胞、人肠道细胞等的体外细胞培养体系已用于诺如病毒(NoV)等病毒的滴度分析，但其准确性仍不理想。因此，针对具体的病毒分析，选择的细胞系除了允许病毒进行复制外，还需对病毒感染敏感，特别是通过观察或量化细胞病变损伤的分析方法。

　　2 病毒感染力评价方法

　　2.1 PFU 法

　　PFU 法也称蚀斑法，空斑试验法。不同稀释浓度的病毒感染细胞后，将液体培养基替换为固体或半固体基质以限制病毒向邻近细胞的传播，在单层细胞上形成一个可见的孔或 “斑块”，通过显微镜或染色辅助对斑块进行计数来获得病毒滴度。假设每个斑块是由单个感染性病毒颗粒引起的，则滴度报告为 PFU。PFU 法是直接定量感染性病毒和抗病毒物质最准确的一种方法，方法灵敏，但耗时(2-14d)、费力、通量低，且人工计数容易导致误差大。除了可评估病毒的感染性，PFU 法还可用于病毒复制能力的分析，其检测依赖于宿主细胞感染病毒后由于形态损伤导致的局部病灶，如细胞收缩或肿胀、变圆、细胞聚集、脱落等。此外，若细胞对病毒侵袭的敏感度不高，则可能难以形成斑块或形成斑块的时间长，而分析周期长则影响操作的通量。因此，PFU 法测定病毒滴度需考虑多个因素，包括敏感宿主细胞选择、细胞和病毒生长增殖的合适培养基和生长条件、病毒固定用涂层基质、病毒潜伏期的准确判别等。

　　限制病毒传播选择的涂层基质是影响 PFU 结果准确性的关键因素。常用的涂层基质为固体或半固体，如琼脂糖、羧甲基 / 甲基纤维素等。但传统的涂层材料使用时需要加热融化，增加了后续移除处理的操作难度并影响分析结果的精确度。为克服这些局限，一些新型的液体涂层已被开发用于空斑试验，如微晶纤维素、羧甲基纤维素钠等。由于液体涂层材料无需加热、加载和去除方便，因此适用于热敏性病毒的斑块分析。但液体基质涂层需要注意溶剂的选择是否会影响细胞的正常生长以及颜色、透明度对斑块形成的监测。手动计数耗时且斑块较多或面积较小时容易存在计数误差，迫切需要自动计数工具的辅助分析。目前已有系列基于斑块图像采集的自动计数软件，如 ImageJ、OpenCV、Labview 等。Phanomchoeng 等开发了一种基于机器学习(Machine learning, ML)的病毒斑块计数自动量化设备，可快速从多孔板中自动获取单帧或多帧图像，通过 ML 和无监督学习算法的 K 均值聚类分析获得结果。设备对登革热病毒感染性分析具有较好的重复性和再现性，准确率为 85.8%。此外，2021 年美国 Cellular Technology Limited 公司开发了名为免疫斑点 CLT 分析仪的商用酶联免疫斑点(Elispot)和病毒噬斑计数仪。这类设备可以快速自动获取每个孔板的高分辨率图像，并使用软件自动计数斑块。但这些程序尚不能直接针对各种病毒斑块进行优化和标准化，且商用计数设备及其服务器通常价格昂贵。

　　2.2 终点稀释法

　　终点稀释法是通过倍数稀释病毒进行感染能力测定的方法。TCID、细胞培养感染剂量(Cell culture infectious dose, CCID)和卵感染剂量(Egg infectious dose, EID)是 3 个主要的病毒感染细胞浓度单位。TCID 是指使 50% 细胞发生病毒感染的病毒量的浓度，而 CCID 是以细胞的增殖作为感染指标，EID 则以鸡胚为感染宿主的病毒量浓度单位。其中，TCID 或 CCID 值不直接对应一个被感染的细胞。与 PFU 法不同，TCID 法不限制病毒扩散，通过活细胞染色来检测细胞存活率并计算获得病毒的滴度。一般认为，TCID 法测定的病毒滴度在 5 到 10 个因子范围内，而 PFU 法可精确到 2 个因子范围内。

　　Reed-Muench(RM)、Spearman-Kärber(SK)以及 Improved-Kärber 法是 TCID 的经典计算方法。Lei 等对比了这三种计算方法性能，并开发了一个在线计算器(https://www.virosin.org/tcid50/TCID50.html)，输入数据即可计算 TCID₅₀值。但 RM 和 SK 法使用几何参数来估计孔板内 50% 的细胞被感染的稀释度，所假设的检测稀释度是独立的，使用理论稀释曲线进行拟合计算可能导致计算结果误差大，且难以解决感染多重性问题。Cresta 等提出了采用 Specific Infection(SIN)取代 ID50 的计算并开发了一个开源在线计算程序(https://midsin.physics.ryerson.ca)。该方法根据 TCID 试验结果，采用贝叶斯推论计算病毒的 SIN 浓度，结果输出值 TCID₅₀/mL 替代为 SIN/mL 对应于每 mL 样本引起的病毒感染数量。以甲型流感病毒感染肾上皮 MDCKs 细胞验证了该方法的计算性能，结果表明其可准确量度病毒感染能力。

　　尽管 TCID 法耗时(7-14d)且操作繁琐，但自 1938 年建立以来广泛应用于多数动物病毒的滴定。Zapata-Cardona 等比较了 PFU TCID 和实时 RT-PCR 3 种方法分析冠状病毒感染力的效果，发现 TCID 与 PFU 法对 SARS-CoV-2: D614G 毒株的检测效果相当，但不适用于其他的 SARS-CoV-2 变异株病毒(如 Alpha、Gamma、Delta 和 Mu 毒株)。为提高方法的稳健性和通量，Hochdorfer 等开发了一种改进的无标记 TCID 法，使用自动图像分析来确定细胞融合度以区分 CPE 阳性和阴性，并采用半自动台式移液机器人完成移液操作。该方法将阴性对照的平均 “细胞面积” 用作参考值并设置为 100%，若一个孔中的细胞融合度≥90%，自动图像分析将该孔识别为 CPE 阴性，当融合度低于 90% 时，则为 CPE 阳性。与传统的 TCID 分析相比，该方法分析速度提高了约 3.6 倍，标准化程度更高，CPE 分析时间从 3.5 h 减少到 15 min，但设备成本较高。

　　2.3 FFU 法

　　FFU 法也称焦点形成测定法(Focus forming analysis, FFAs)，其原理是通过在感染期间细胞中表达的病毒抗原荧光染色来确定病毒滴度，是一种抗体标记的免疫染色分析技术。与 PFU 和终点稀释法不同，FFU 分析的病灶是由表达病毒蛋白的 2-5 个细胞组成的小细胞群组成，而不是大量细胞死亡形成的空斑。因此，FFU 分析周期较短(约 2 天)，且基于抗原抗体特异识别的结果精度大大提高。同时，荧光成像可实现高通量和自动化操作，可避免手动计数的主观误差，这些优势促进了 FFU 法的推广应用。对重组新城疫病毒(rNDV)滴度测定发现，与 PFU 法(总体变异 0.08 PFU/mL)相比，FFA 法(0.10 FFU/mL)测得的病毒滴度偏高，变异系数(6%-13%)和标准差较低，在 rNDV 滴度测定上具有高通量、快速、自动化、可重复性高等优势。此外，FFU 法已广泛应用于多种病毒的感染性分析(表 1)，如汉坦病毒、疱疹病毒、丝状病毒等。

　　FFU 法的专业分析软件与成像设备配套已实现商业化。Keiser 等基于开源 CellProfiler 软件平台，开发了一种 FFU 法联合计算机自动图像处理的方法。软件自动图像处理速度快，30 min 内可处理 100 个图像对。在 3 种丝状病毒滴度分析中，虽然 FFU 法联合比 PFU 法的联合多 10 倍的病灶量，且比 TCID 检测灵敏 100 倍，但这 3 种方法获得的最低变异系数(Coefficient of variation, CV)一致。此外，Stewart 等认为可通过准确计算感染细胞数量获得病毒感染滴度(IU/mL)。病毒感染的细胞经免疫荧光染色后进行成像并计算感染细胞数，将每个孔的病毒阳性细胞数乘以相应稀释系数的倒数可获得病毒滴度，并根据输入量进行校正。该方法测定的是感染细胞的绝对数量，而不是感染细胞的病灶数量，且具有较宽的线性检测范围，适用于潜在抗病毒化合物的高通量筛选。相似地，通过使用病毒特异性单克隆抗体进行免疫染色后，采用流式细胞术法来区分未感染细胞可提高分析的通量。值得注意的是，用抗原阳性细胞数量作为原始样品中感染单位的替代测量必须满足三个条件：感染复数必须小于 1、感染不受布朗运动的限制、累积复制周期数小于或等于 1。

　　与空斑法相比，特异性抗体是 FFU 法的关键限制因素，且 FFU 法仅定位病毒蛋白亚单位而不是实际感染性病毒的能力。对于一般样本中病毒污染的感染能力评价，高活性抗体开发可提高方法的精度和准确性。Li 等以安卡拉牛痘(Ankara)病毒感染肾 BHK-21 细胞，经异硫氰酸荧光素偶联的抗体孵育后，采用流式细胞仪进行感染性病毒蛋白量化。该方法不依赖于病毒的扩增，但需优化感染时间。此外，抗体标记成本高，且抗体蛋白的活性影响分析的性能。为解决病毒识别元件这一局限问题，Park 等利用适配体筛选技术筛选了 4 种抗丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)E2 适配体，构建了一种定量感染性 HCV 颗粒的滴度分析方法，发现二价适配体的检测灵敏度比一价高约 4 倍。该方法检测原理与酶联免疫吸附试验相似，利用辣根素过氧化物酶(HRP)的化学发光性能量化 E2 蛋白浓度，而 E2 蛋白浓度与感染性 HCV 滴度呈线性相关，但与 HCV 的 RNA 含量无关，以此间接评估病毒的感染性。

　　2.4 激光力细胞学法

　　激光力细胞学(Laser force cytology, LFC)是一种用于病毒感染细胞分析的微流体方法，具有高通量、无标记的应用优势。CPE 分析表明，病毒感染的敏感细胞在形态上与未感染的细胞存在差异，且病毒颗粒增殖后使得感染细胞内的蛋白质和核酸含量发生变化，进而导致单个细胞的折射率变化。因此，利用感染细胞的这些形态学和光学特性可区分感染与未感染细胞，从而间接量化病毒的感染能力。利用这一原理构建了病毒滴度分析的 LFC 平台。LFC 可对单个细胞施加光学和流体力，细胞通过与激光束相反的分析通道，激光束沿着通道的长度聚焦，激光束的光力可减缓细胞的流体阻力并沿着光束轴拉伸细胞，同时收集细胞动力学数据，如细胞光力、大小和可变形性的生化和形态特性。用于一般的活性病毒筛选时，LFC 必须能通过识别细胞特性变化来检测孔内细胞的 CPE。因此，选择的细胞系必须对目标病毒敏感以确保 LFC 法的灵敏度。但该方法需要高精度的 LFC 设备，设备成本较高，且需要专业人员的熟练操作，限制了 LFC 法的推广应用。

　　LFC 法的整体分析时间较 PFU 和终点稀释等方法时间显著缩短。Hebert 等将包括速度、大小、大小归一化速度和偏心率测定及各自标准差的 LFC 数据(X 变量)与计算获得的 TCID 值(Y)作为变量数据，利用 PLS_toolbox 多变量分析软件获得潜在变量，再将该变量用作病毒感染度量的变量(X)，进一步与 TCID 值(Y)绘制获得多变量滴度校准曲线。应用所构建的 LFC 法分析了水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV)在 Vero 细胞中的感染能力，方法具有良好的线性关系且分析时间显著缩短，从 VSV 感染到滴度测定仅需 16 h，较传统操作所需时间缩短了 4.5 倍。为了验证 LFC方法是否适用于不同病毒和细胞模型的滴度检测，Dirks 等开展了 3 种细胞系和 3 种病毒两两组合的 LFC 数据(第 14 d)进行独立主成分(PCA)分析，以对照组得分生成未感染细胞的前两个主要成分的平均值和 95% 置信限。当 PCA 分数落在置信区间之外则被认为是病毒感染的阳性样本，并将获得的每个特征输入的系数用于相同细胞和病毒组合的所有时间点样本分析。LFC 在某些病毒和细胞组合中的检测速度显著提高，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的小鼠微小病毒(Mouse minute virus, MMV)以及呼肠孤病毒 3 型的感染，分析时间提前了 4d，检出限降低了 10 倍。但并非在所有病毒和细胞组合中都能获得相似的结果，如 Vero 细胞中的小鼠肝炎病毒和呼肠孤病毒 3 型感染在获得 0.1 TCID₅₀/mI 滴度的时间并未缩短。

　　2.5 PCR 法

　　PCR 法广泛应用于病毒的检测，该技术无法独立用于区分感染性病毒的分析。有研究表明，在病毒的对数增殖阶段，疫苗中感染性病毒的数量对数(log₁₀C0)值与循环阈值 Ct 间呈线性相关，可通过 PCR 法间接量化病毒感染能力。Manukyan 等构建了一种使用定量多重聚合酶链反应(Multiplex PCR-based titration, MPBT)作为终点的不同血清型脊髓灰质炎病毒滴定方法。将宿主细胞暴露于连续稀释的病毒中孵育 2d，采用 qmost RT-PCR 法对细胞裂解物中的核酸进行多重定量。qmost RT-PCR 可确定病毒是否复制，而非获得 Ct 值进行病毒滴度量化。因此，这种检测方法可检测活病毒，不能检测灭活病毒颗粒中的核酸。基于 MPBT 的滴度分析具有较好的重现性、稳定性和灵敏度，试验周期缩短，且结果与 TCID 法结果相似。此外，Duong 等通过采用 PCR 法检测细胞裂解物中的核酸含量提高了 TICD 测试方法的性能，并对比了 qPCR 法和液滴数字 PCR(Droplet digital PCR, ddPCR)法的效果。以重组腺病毒感染 HeLaRC32 细胞验证，发现通过增加一个感染性评分的二级阈值可显著提高 ddPCR 分析的精度，避免了最高稀释倍数组的潜在假阳性。

　　研究发现，通过破坏病毒衣壳降解灭活病毒核酸后，对感染性病毒进行 PCR 分析可判断病毒感染能力。例如，利用蛋白酶 K 预处理降解灭活病毒衣壳后，再采用核酸酶进一步降解暴露的核酸，则仅具有感染性的病毒可通过 PCR 法检测。病毒衣壳破损后利于染料与病毒核酸交联，进而抑制其 PCR 扩增，一定程度上可降低结果的假阳性。在提取热处理后的甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus, HAV)RNA 进行 RT-qPCR 分析前，采用 50 μM PMA 叠氮溴化丙锭(Propidium monoazide, PMA)预处理可将 HAV 滴度降低 2.4 log10 单位以上。此外，PMA 结合 RT-PCR 可选择性地区分感染性和热氯灭活脊髓灰质炎病毒，但仅能区分氯灭活处理的感染性和灭活小鼠诺如病毒，难以区分感染性和灭活的诺瓦克病毒，对紫外辐照处理的灭活病毒和感染性病毒效果不佳。该方法区分感染性病毒依赖于衣壳的损伤程度，对于衣壳稳定性高的病毒需要优化前处理条件，且难以保证灭活病毒的核酸完全抑制或水解，限制 PCR 方法的应用。

　　2.6 其它检测方法

　　人工智能和视觉图像技术在提高病毒感染力分析的自动化和智能化方面具有显著优势。Dodkins 等通过收集的含有稀释病毒样本的明场图像，使用计算机视觉方法构建了一种基于卷积神经网络模型的自动病毒感染性测定方法(AVIAᵀᴹ)。该方法灵敏度与 PFU 和 TCID 法相当或更优，检测精度约 10%，无需细胞固定和染色，易于自动化和高通量，重复性和安全性高。由于不同病毒和细胞系组合的动力学存在差异，针对特定的病毒和细胞系，均需优化特征信号采集的最佳时间，以保证训练模型的准确性和重复性。此外，以细胞为识别元件的细胞生物传感技术为病毒滴度分析提供了更为灵敏的方法。由 Roche Applied Science 公司开发的 xCELLigence 系统实时细胞分析(RTCA)，使用微电子生物传感器技术对细胞事件进行动态、实时、无标记和原位分析，包括细胞数量、细胞活性、粘附能力、形态和运动。Teng 等结合电子细胞传感器阵列 - xCELLigence RTCA 系统和 CPE，基于细胞在电极表面粘附变化与电阻抗变化的相关性，分析了人肠病毒 71 型(Enterovirus 71, HEV71)在 RD 细胞中的感染能力。与 TCID 法比较，基于电阻抗的传感检测方法灵敏度高，主观误差小，但电化学方法自身的稳定性限制了其应用。

　　开发无细胞的病毒感染能力评价方法对降低实验室内或实验室间的重复操作偏差具有潜力。Liu 等采用快速捕获荧光原位杂交(Dubbed rapid capture fluorescence in situ hybridization, rapture FISH)技术构建了靶向病毒基因组和外壳蛋白的无细胞快速检测方法。该方法结合了用于基因组检测的 RT-PCR 和用于表面抗原检测的 ELISA 的优点，在无细胞模型的情况下分析病毒的感染性。使用适配体捕获携带完整外壳蛋白的病毒后使用 FISH 法检测单个感染性病毒粒子基因组，从而判别病毒粒子的感染性(外壳蛋白阳性、基因组阳性)。Rapture FISH 法有望实现多种病毒体类型的同步检测，靶向不同基因组区域的探针联合使用可提高病毒 RNA 检测的特异性。但无细胞的病毒滴度检测方法研究较少，方法性能和结果可靠性等方面仍缺乏说服力。

　　3 总结与展望

　　目前，病毒滴定方法严重依赖于体外培养细胞，仍以经典的 PFU 法、终点稀释法和 FFU 法为主。分析周期长、投入成本高、灵敏度和精度低等局限使得这些方法难以满足通量化的抗病毒药物筛选、不同场景条件采集的样品中感染性病毒污染信息的快速反馈需求。虽然已有基于传统方法的染毒处理操作以及数据采集与分析的优化方法开发，但大部分仅为验证与 PFU 法和 TCID 法检测的效果。且由于病毒种类繁多，病毒的性质显著影响方法的普适性，新技术新方法的真正推广应用较少。针对 FFU 和 FLC 法有商业化的分析软件和配套的设备，但设备昂贵难以在实验室间推广。因此，开发经济、短时、精度高、自动化、智能化和高通量的感染性病毒分析方法和技术极具必要性。有机融合人工智能、计算机视觉、大数据等技术有助于实现病毒感染能力检测的自动化和智慧识别以及搭建分门别类的病毒基础信息数据库、逐步形成分类病毒感染性的标准化规范，在许可范围内共享数据资源，打破现有数据库信息孤岛的局限。

叶永丽;李梓暄;刘丽娟;孙秀兰;纪剑,江南大学食品学院;中国检验检疫科学研究院,202501